Дендритные клетки иммунной системы. Иммунологическое обследование при вирусной инфекции Повышенный уровень лимфоцитов

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Ученые объединили методы иммунотерапии, цитотерапии и генотерапии для перепрограммирования Т-лимфоцитов в потенциальных «убийц» раковых клеток. Но и этого оказалось недостаточно - следующим шагом стало создание молекулярного «выключателя», с помощью которого можно регулировать время и силу действия активированных Т-клеток. Инновационный метод закладывает основу для резкого сокращения серьезных (а иногда и смертельных) побочных эффектов, вызванных терапией с использованием модифицированных Т-клеток.

Обратите внимание!

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни ». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon .

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science .

Медицина перешла на новый уровень: клетки стали живым лекарством

В последнее время в терапии опухолевых заболеваний особое внимание уделяется адоптивной иммуноцитотерапии (от англ. adoptive - приемный). При этом часть клеток иммунной системы пациента искусственно «натравливают» на опухолевые клетки. Суть метода состоит в том, чтобы отобрать у пациента необходимые иммунные клетки, обработать их - например, иммунными цитокинами (небольшими белками, выполняющими функции регуляторов деления и дифференцировки специфических иммунных клеток), - а затем вернуть в организм уже активированные клетки, которые и будут помогать бороться с опухолями* (рис. 1).

* - Эта тема является одной из самых горячих направлений клинической иммунологии - см. статью «Хороший, плохой, злой, или Как разозлить лимфоциты и уничтожить опухоль » . - Ред.

Впервые метод адоптивной иммуноцитотерапии был описан еще в 1988 году - у пациентов с метастатической меланомой (то есть раком кожи на четвертой стадии) наблюдалась регрессия заболевания при терапии с помощью их TIL-клеток (лимфоцитов, инфильтрующих опухоль) . В настоящее время терапия метастатической меланомы на основе TIL-клеток является наиболее эффективным способом лечения данного заболевания, поскольку регрессия опухоли наблюдается у половины пациентов .

Существует несколько вариантов клеток, которые используются в адоптивной иммунотерапии; из них три используются при терапии опухолевых заболеваний: уже знакомые нам TIL-клетки (лимфоциты, инфильтрующие опухоль), LAC-клетки (лимфокин-активированные киллеры) и CIK-клетки (цитокин-индуцированные киллеры). На самом деле собственные Т-клетки организма тоже стараются бороться с опухолевыми клетками, только зачастую опухолевые клетки им «не по зубам». Не то, чтобы совсем - ведь существует иммунный надзор, осуществляемый Т-клетками и естественными киллерами (NK-клетками), с помощью которых иммунная система старается защититься от опухолей, - однако это вовсе не стопроцентная защита. Однако случается, что иммунный надзор не всегда достаточно силен, чтоб предотвратить развитие опухолей: так, при длительном применении иммунодепрессантов после трансплантаций органов повышается частота развития многих опухолей .

Необходима система наведения

Несмотря на сложность получения модифицированных клеток, а также сопутствующий риск возникновения серьезных побочных эффектов, все же главной проблемой метода иммуноцитотерапии является отсутствие способов прицельной доставки вводимых модифицированных иммунных клеток в опухоль. Раковые клетки часто делаются практически «невидимыми» для иммунной системы, и они образуют микросреду, которая подавляет активность и миграцию Т-клеток . Для того, чтобы сбросить мантию-невидимку с опухолевых клеток, Т-лимфоциты надо не только активировать, но и придать им способность прицельно узнавать опухолевые клетки. Т-клетки могут быть перепрограммированы методами генной инженерии путем введения генов, кодирующих рецепторы к опухолевым антигенам (TAA, tumour-associated аntigens) - оснащения собственной «системой наведения». Также можно заодно ввести гены для придания Т-клеткам устойчивости к иммуносупрессии для увеличения выживаемости или облегчения проникновения сконструированных Т-клеток в опухоль. В итоге, могут быть получены высокоактивные «наемные убийцы» раковых клеток .

Для получения эффективных «убийц» Т-лимфоциты модифицируют путем оснащения их искусственными химерными антигенными рецепторами (CAR, chimeric antigen receptors). Рецепторы химерные, поскольку одна часть (распознающая) была «позаимствована» у моноклональных антител, а часть, передающая сигнал, - у Т-клеточного рецептора (ТCR). В качестве внеклеточной «распознающей» части обычно служат вариабельные домены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов необходимой специфичности (scFv), которые образуют специфичный к опухолевым клеткам антиген-связывающий участок (рис. 2).

Рисунок 2. Структура химерного антигенного рецептора (CAR). CAR состоит из внеклеточного домена (одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела (scFv)), соединенного с помощью цепей и трансмембранных доменов с цитоплазматической сигнальной областью. Гены, кодирующие scFv, получены из В-клеток, продуцирующих антитела, специфичные к опухолевому антигену. CAR существует в виде димера, и распознавание опухоли происходит напрямую (без участия MHC). Рисунок из .

Все новое - это хорошо забытое старое. Первые Т-клетки с химерным антигенным рецептором были получены командой ученых под руководством профессора Эсхара (Zelig Eshhar ); результаты работы были опубликованы еще в 1989 году . Эсхар понял, что, обладая данной техникой, Т-клетки можно запрограммировать на нацеленную атаку.

Однако с момента обнаружения химерных антигенных рецепторов до внедрения технологии в практику прошло больше 20 лет. За это время были улучшены химерные антигенные рецепторы - были созданы CAR 2-го поколения, в которые был внесен дополнительный сигнальный домен костимулирующей молекулы, который позволил улучшить активацию Т-клеток и их распространение. В CAR 3-го поколения был добавлен еще один сигнальный домен, что в конечном итоге повысило уровни выживания и размножения модифицированных Т-клеток (рис. 3). В конечном итоге были улучшены способность к «выслеживанию» опухолевых клеток, а также уменьшены побочные эффекты.

Рисунок 4. Бутылка с питательной средой для Т-клеток , которые после введения в них нового рецептора выращивают около 10 дней до достижения ими количества в несколько миллиардов. Тогда они могут быть введены в вены пациента. Рисунок из .

Первые клинические испытания генетически модифицированных Т-лимфоцитов, несущих химерные антигенные рецепторы, прошли в 2012 году. Они выпали на долю девочки по имени Эмили, больной острой лимфобластной лейкемией. После того, как генетически модифицированные Т-клетки были обратно введены девочке, ее состояние резко ухудшилось, и она провела несколько недель в отделении интенсивной терапии на искусственной вентиляции легких. В какой-то момент жизнь Эмили висела на волоске, но в итоге девочка поправилась, и уже три года в ее организме врачи не находят даже единичных раковых клеток .

Побочные эффекты новой терапии

Несмотря на то, что иммуноцитотерапия Т-клетками с CAR является прорывом в области лечения опухолевых заболеваний, есть еще ряд опасностей, которые могут поджидать за углом. Доктор Карл Джун (Carl June ) из университета Пенсильвании был одним из первых, кто опубликовал успешные результаты лечения модифицированными Т-клетками, сравнил то, что происходит внутри тела пациента с «серийным убийством» и «массовым убийством». Когда миллиарды Т-клеток, которые были введены в организм, поделятся, то они смогут обнаружить и убить несколько фунтов опухоли. Но в этом тоже немало риска - многие пациенты страдают от синдрома высвобождения цитокинов (цитокинового шторма) - при борьбе Т-клетки с опухолевой клеткой высвобождается большое количество молекул цитокинов, что представляет угрозу для самого организма. Так, семь пациентов умерло вследствие этого синдрома .

Побочные эффекты связаны с мощной иммунной активностью модифицированных Т-клеток. Одним из камней преткновения является риск высокой токсичности, не позволяющий ввести подобное лечение на регулярной основе. «Т-клетки - действительно мощные создания» , - говорит профессор Венделл Лим (Wendell Lim ), заведующий отделом Департамента клеточной и молекулярной фармакологии Калифорнийского университета. - «Будучи активированными, они могут вызвать смерть. Нам необходима система удаленного контроля, которая сохранит силу этих модифицированных Т-клеток, и позволит специфично „общаться“ с ними и управлять Т-клетками, находящимися в организме» .

Т-клетки взяли под контроль

Ученые из Калифорнийского университета в Сан-Франциско создали молекулярный «включатель», с помощью которого можно управлять действиями генноинженерных Т-лимфоцитов. Как и обыкновенные Т-клетки, несущие CAR, новые Т-клетки с «включателем» будут взаимодействовать с опухолевыми клетками, но не будут переходить «в атаку», пока не будет введен специальный препарат. Данный препарат является своеобразным «химическим мостиком» внутри Т-клеток: он запускает иммунные реакции, «включает» их, переводя в активное состояние. Когда препарат перестает циркулировать в крови, Т-клетки снова переходят в «выключенное» состояние (рис. 5).

Рисунок 5. Титруемый контроль генноинженерных Т-клеток с помощью включаемого химерного антигенного рецептора. С обычным CAR Т-клетки активируются при соединении с клеткой-мишенью, при этом из-за очень сильного иммунного ответа есть риск высокой токсичности. «Включаемый» CAR требует небольшую стимулирующую молекулу для запуска терапевтической функции. Величину ответа (например, «убийства» клеток-мишеней) можно титровать, тем самым уменьшая токсичность при уменьшении количества небольшой стимулирующей молекулы. Рисунок из .

Внедрение «пульта управления» в Т-клетку с химерным антигенным рецептором - это пример простой и эффективной стратегии совмещения собственных и автономных решений клетки (например, обнаружение сигналов болезни) с контролируемыми пользователем из вне. Перегруппировка и расщепление основных частей CAR обеспечивает возможность «включения» и «выключения» химерных антигенных рецепторов. Данная работа также подчеркивает важность разработки оптимизированных биоинертных «пультов управления», таких как небольшие молекулы и свет, вместе с их клеточными компонентами реагирования, в целях повышения точности контролируемой терапии .

Таким образом, правильно дозируя препарат, можно управлять уровнем иммунной активности модифицированных Т-клеток. В частности, благодаря данной технологии можно снизить отрицательные последствия синдрома высвобождения цитокинов. Также иногда нормальные клетки экспрессируют небольшие количества белков, которые являются мишенью для Т-клеток с CAR. Поскольку модифицированные Т-клетки вводят в кровяное русло и они проходят через сердце и легкие, ткани этих органов могут быть повреждены прежде, чем Т-клетки достигнут своих намеченных целей в других частях тела. А с новой технологией Т-клетки будут в «выключенном» состоянии, пока не достигнут цели .

Иммунотерапия с помощью Т-клеток с CAR успешна против рака крови, но, когда дело доходит до твердых опухолей, которые образуются в толстой кишке, молочных железах, мозге и других тканях, модифицированные Т-клетки до сих пор не показывают высокой эффективности. Возможно, метод дистанционного управления Т-клетками позволит разработать более мощные версии химерных антигенных рецепторов, которые позволят Т-клеткам поражать твердые опухоли, при этом не обладая серьезными побочными эффектами.

Литература

1. Хороший, плохой, злой, или Как разозлить лимфоциты и уничтожить опухоль ;
2. Rosenberg S.A., Packard B.S., Aebersold P.M., Solomon D., Topalian S.L., Toy S.T. et al. (1988). Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report . ;
3. Regalado A. (2015). Biotech’s coming cancer cure . MIT Technology Review ;
4. Farley P. (2015). ‘Remote control’ of immune cells opens door to safer, more precise cancer therapies . University of California San Francisco ;
5. Wu C., Roybal K.T., Puchner E.M., Onuffer J., Lim W.A. (2015). Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor . Science . 350 , aab4077..

иммуноглобулинов (в начале иммунного ответа B-клетки синтезируют IgM , позже переключаются на продукцию IgG , IgE , IgA).

Энциклопедичный YouTube

1 / 5

✪ B-лимфоциты и T-лимфоциты популяций CD4+ и CD8+

✪ Цитотоксические T-лимфоциты

✪ T-лимфоциты

✪ Лимфоциты

✪ B-лимфоциты (B-клетки)

Субтитры

Я уже рассказал об основных клетках специфической иммунной системы, а сейчас мы еще раз обобщим изученное. Давайте начнем с B-лимфоцита, которого я всегда рисую синими цветом.. Вот он перед вами. У B-лимфоцитов на поверхности присутствуют мембранные иммуноглобулины, причем у каждого такого лимфоцита свой вариант вариабельного домена. Повторю: у B-лимфоцитов на поверхности есть мембранные иммуноглобулины, и у каждого такого лимфоцита свой вариант вариабельного домена. Вариабельные домены нарисую розовым. У другого B-лимфоцита будут другие вариабельные домены. Поэтому они могут реагировать на самые разные антигены, проникшие в организм. При этом B-лимфоциты активируются. Что для этого нужно и что при этом происходит? Давайте поговорим о том, что происходит при активировании В-лимфоцитов. Что нужно для запуска активации? Для этого нужно, чтобы патоген связался с мембранным иммуноглобулином. Запишем, что патоген связывается. Патоген связывается с мембранным иммуноглобулином. Но этого мало. Обычно B-лимфоциту нужна стимуляция T-лимфоцитом. Так и пишем: стимуляция Т- лимфоцитом. В какой ситуации необходима такая стимуляция? B-лимфоцит является антигенпрезентирующей клеткой. Он поглощает антиген, расщепляет его и демонстрирует вместе с ГКГ класса 2. Его мы тоже сейчас нарисуем. Это ГКГ класса 2. С ним связываются фрагменты антигена. С этим комплексом связывается активированный T-хелпер, у которого есть рецептор с вариабельным доменом, специфичным для этого конкретного антигена. Да, кривоватый получился рецептор, но суть ясна, по крайней мере, я буду на это надеяться. После активации следует дифференцировка: клетка делится, и ее потомки могут стать эффекторными клетками. Это справедливо и для T-, и для B-лимфоцитов. После активации лимфоцит производит эффекторные клетки и клетки памяти. Клетки памяти сохраняются надолго, и их в результате деления получается много. При повторном проникновении того же патогена он с большой вероятностью наткнется на клетку памяти, запустив быстрый иммунный ответ. Эффекторные B-лимфоциты – это фабрики по производству иммуноглобулинов. Итак, эффекторные B-лимфоциты – производят иммуноглобулин. Логика такая: раз антитело подходит к антигену, попавшему в организм, нужно синтезировать побольше. Все производственные мощности клетки принимаются синтезировать антитела. Расскажу вам один факт, который мне подсказала жена. Подслушав то, как я записывал прошлое видео. Она специалист в гематологии и разбирается в иммунологии, так что я ей в этом доверяю: она в этом деле эксперт. В прошлом ролике я опрометчиво заявил, что антитела вырабатывают активированные эффекторные B-лимфоциты. Так оно и есть на самом деле – антитела вырабатываются исключительно B-лимфоцитами. Однако, для секретирующих антитела клеток есть свое название. Эти эффекторные B-лимфоциты обычно называют плазматическими клетками. Запишу термин. В ходе дифференцировки меняется название. Так называют B-лимфоцит, который начал выделять антитела. После этого его называют исключительно плазматической клеткой. Так что на вопрос о том, какие клетки производят антитела, не отвечайте, что это B-лимфоциты. Правильным будет ответ: плазматические клетки. Это общепринятый термин, используемый в иммунологии, а также ревматологии. Простите, я сказал, что моя жена – гематолог? Нет, она ревматолог. Иногда я в этом путаюсь. Так вот, суть B-лимфоцито в производстве антител, которые свяжутся с антигенами вирусов или бактерий и сделают их заметными для макрофагов и прочих фагоцитов. Но вот и все о них, теперь переходим к T-лимфоцитам. Я расскажу о них то, чего не было в прошлых роликах. Так вот, существует две разновидности T-лимфоцитов. Вы уже знаете о хелперах и цитотоксических T-лимфоцитах, но есть и другая классификация лимфоцитов, и я расскажу вам о ней. Итак, две разновидности. У обеих – T-клеточный рецептор. Нарисую его вот таким образом. T-клеточный рецептор. Кроме того, на их мембранах есть ряд других белков. У некоторых T-лимфоцитов есть мембранный белок, называемый CD4. CD4. У других T-лимфоцитов есть другой белок – это CD8. Его тоже подпишем. CD8. Лимфоцит справа называется CD8-положительным T-лимфоцитом. У него на мембране есть CD8. А вот CD4-положительный T-лимфоцит. Вот две разновидности. Их разделяют по этим белкам. Белок CD4 – это рецептор, который имеет сродство с белками ГКГ класса 2. Большинство CD4-положительных клеток – это T-хелперы. В большинстве случаев, если в разговоре упоминают CD4-положительные клетки, то по привычке имеют в виду именно хелперные T-лимфоциты. Обычно говорят о них. Пожалуй, я подпишу его - T-хелпер. Рецептор CD8 имеет сродство с ГКГ класса 1. Укажем это на рисунке. У раковых клеток ГКГ класса 1 на мембране связан с антигенами рака. Поэтому CD8 характерен для цитотоксических лимфоцитов. CD8 характерен для цитотоксических лимфоцитов. Обычно до того как клетка активирована, ее называют CD4- или CD8-положительной, а о функции лимфоцита говорят уже после активации. Уже после. Это особенности терминологии. Надеюсь, суть вы улавили. Теперь вспомним, чем занимается этот лимфоцит. Он связывается с белками ГКГ, которые находятся на мембране вместе с антигенами. Вот ГКГ класса 1. Как я уже говорил в прошлом ролике, он есть у каждой клетки с ядром. Допустим, в клетке произошло что-то плохое. Что-то нехорошее, может быть, это вирус. Может быть, рак. Пораженная клетка должна умереть, иначе она будет копировать вирус или размножаться, если это опухоль. Так вот, CD8-положительные T-лимфоциты убивают клетки, пораженные вирусом или онкологией. Они убивают пораженные клетки, которые в противном случае могли угрожать всему организму, в целом. T-хелперы – совсем другое дело. Давайте возьмем дендритную клетку – антигенпрезентирующую клетку. У нее есть ГКГ класса 2, с которым соединяются фрагменты переваренного антигена. Он активирует хелперные T-лимфоциты, которые делятся и дифференцируются в эффекторные клетки, а так же клетки памяти. У эффекторного T-лимфоцита есть несколько функций. Хелперный T-лимфоцит активирует B-лимфоциты и выделяет цитокины. Выделяет цитокины. Активированный лимфоцит выделяет множество веществ, которые служат сигналом другим клеткам, например другим лимфоцитам, поднимая при этом тревогу. Часть этих цитокинов помогает цитотоксическим лимфоцитам в их активации. Цитокины поднимают тревогу, и CD8-положительные, то есть цитотоксические T-лимфоциты, эффекторные лимфоциты, принимаются убивать клетки. Что касается клеток памяти, то это копии оригинальных лимфоцитов, которые надолго сохраняются в этом месте на случай повторения угрозы, чтобы обеспечить более быстрый ответ. Надеюсь, что не сильно вас запутал новыми терминами, но это было необходимо. И теперь вы знаете, что антитела синтезируют не B-лимфоциты, не их, а клетки, у которых есть собственное название. Это плазматические клетки или плазмоциты.

Типы Т-лимфоцитов

Т-лимфоциты, обеспечивающие центральную регуляцию иммунного ответа.

Дифференциация в тимусе

Все Т-клетки берут своё начало от гемопоэтических стволовых клеток красного костного мозга , которые мигрируют в тимус и дифференциируются в незрелые тимоциты . Тимус создаёт микросреду, необходимую для развития полностью функционального репертуара Т-клеток, который является ГКГ-ограниченным и толерантным к самому себе.

Дифференциация тимоцитов разделяется на разные стадии в зависимости от экспрессии различных поверхностных маркеров (антигенов). На самой ранней стадии, тимоциты не экспрессируют корецепторы CD4 и CD8, и поэтому классифицируются как двойные негативные (англ. Double Negative (DN) ) (CD4-CD8-). На следующей стадии тимоциты экспрессируют оба корецептора и называются двойными позитивными (англ. Double Positive (DP) ) (СD4+CD8+). Наконец на финальной стадии происходит селекция клеток, которые экспрессируют только один из корецепторов (англ. Single Positive (SP) ): или (CD4+), или (CD8+).

Раннюю стадию можно разделить на несколько подстадий. Так, на подстадии DN1 (англ. Double Negative 1 ), тимоциты имеют следующую комбинацию маркеров: CD44 +CD25 -CD117 +. Клетки с данной комбинацией маркеров ещё называют ранними лимфоидными предшественниками (англ. Early Lymphoid Progenitors (ELP) ). Прогрессируя в своей дифференциации, ELP активно делятся и окончательно теряют способность трансформироваться в другие типы клеток (например В-лимфоциты или миелоидные клетки). Переходя на подстадию DN2 (англ. Double Negative 2 ), тимоциты экспрессируют CD44 +CD25 +CD117 + и становятся ранними Т-клеточными предшественниками (англ. Early T-cell Progenitors (ETP) ). В течение DN3 подстадии (англ. Double Negative 3 ), ETP клетки имеют комбинацию CD44 -CD25 + и вступают в процесс β-селекции.

β-селекция

Гены Т-клеточного рецептора состоят из повторяющихся сегментов, принадлежащих к трём классам: V (англ. variable ), D (англ. diversity ) и J (англ. joining ). В процессе соматической рекомбинации генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе (V(D)J-рекомбинация). Случайное объединение последовательностей сегментов V(D)J приводит к появлению уникальных последовательностей вариабельных доменов каждой из цепей рецептора. Случайный характер образования последовательностей вариабельных доменов позволяет генерировать Т-клетки, способные распознавать большое количество различных антигенов, и, как следствие, обеспечивать более эффективную защиту против быстро эволюционирующих патогенов. Однако этот же механизм зачастую приводит к образованию нефункциональных субъединиц Т-клеточного рецептора. Гены, кодирующие β-субъединицу рецептора, первыми подвергаются рекомбинации в DN3-клетках. Чтобы исключить возможность образования нефункционального пептида, β-субъединица образует комплекс с инвариабельной α-субъединицей пре-T-клеточного рецептора, формируя т. н. пре-T-клеточный рецептор (пре-ТКР) . Клетки, неспособные образовывать функциональный пре-ТКР, погибают в результате апоптоза . Тимоциты, успешно прошедшие β-селекцию, переходят на подстадию DN4 (CD44 -CD25 -) и подвергаются процессу позитивной селекции .

Позитивная селекция

Клетки, экспрессирующие на своей поверхности пре-ТКР все ещё не являются иммунокомпетентными, так как не способны связываться с молекулами главного комплекса гистосовместимости. Для узнавания молекул ГКГ T-клеточным рецептором необходимо наличие корецепторов CD4 и CD8 на поверхности тимоцитов. Образование комплекса между пре-ТКР и корецептором CD3 приводит к ингибированию перестроек генов β-субъединицы и в то же время вызывает активацию экспрессии генов CD4 и CD8. Таким образом тимоциты становятся двойными позитивными (DP) (CD4+CD8+). DP-тимоциты активно мигрируют в корковое вещество тимуса, где происходит их взаимодействие с клетками кортикального эпителия , экспрессирующими белки обоих классов ГКГ (MHC-I и MHC-II). Клетки, неспособные взаимодействовать с белками ГКГ кортикального эпителия, подвергаются апоптозу , в то время как клетки, успешно осуществившие такое взаимодействие, начинают активно делиться.

Негативная селекция

Тимоциты, прошедшие позитивную селекцию, начинают мигрировать к кортико-медуллярной границе тимуса. Попадая в медуллу, тимоциты взаимодействуют с собственными антигенами организма, презентированными в комплексе с белками ГКГ на медуллярных тимических эпителиальных клетках (мТЭК). Тимоциты, активно взаимодействующие с собственными антигенами, подвергаются апоптозу . Негативная селекция предотвращает появление самоактивирующихся Т-клеток, способных вызывать аутоиммунные заболевания клон . Некоторые из клеток этого клона превращаются в эффекторные Т-клетки , которые выполняют функции, специфичные для данного типа лимфоцита (например, выделяют цитокины в случае Т-хелперов или же лизируют поражённые клетки в случае Т-киллеров). Другая часть активированных клеток трансформируется в Т-клетки памяти . Клетки памяти сохраняются в неактивной форме после первичного контакта с антигеном до тех пор, пока не наступает повторное взаимодействие с тем же антигеном. Таким образом, Т-клетки памяти хранят информацию о ранее действовавших антигенах и обеспечивают вторичный иммунный ответ, осуществляющийся в более короткие сроки, чем первичный.

Взаимодействие Т-клеточного рецептора и корецепторов (СD4, CD8) с главным комплексом гистосовместимости важно для успешной активации наивных Т-клеток, однако его самого по себе недостаточно для дифференциации в эффекторные клетки. Для последующей пролиферации активированных клеток необходимо взаимодействие т. н. костимулирующих молекул. Для Т-хелперов такими молекулами являются рецептор CD28 на поверхности Т-клетки и иммуноглобулин B7 на поверхности антигенпрезентирующей клетки.

Под активацией клеток понимают их переход из состояния покоя в функционально активное состояние - макрофаги продуцируют активные формы кислорода, тучные клетки выбрасывают гранулы, мышечные клетки сокращаются и т.д. В случае лимфоцита активация также означает выход из состояния покоя (G0), но в несколько ином смысле: покоящийся лимфоцит находится вне клеточного цикла, а его активация означает вступление в цикл. Это последствие активации лимфоцитов глубоко функционально, поскольку любому проявлению функции лимфоцитов должно предшествовать их размножение (поскольку исходная численности клеток в каждом клоне мала). Это не относится к естественным киллерам - лимфоцитам, популяция которых не имеет клональной структуры. Активация NK-клеток не связана с пролиферацией и означает переход в состояние готовности выполнять цитотоксическую функцию.
Молекулярные основы активации Т-клеток
Активация клеток, в том числе лимфоцитов, всегда сопряжена с экспрессией многих генов. В случае лимфоцитов активация должна приводить прежде всего к экспрессии генов, обеспечивающих пролиферативную экспансию клона. Суть подготовки Т-клеток к пролиферации состоит прежде всего в экспрессии генов аутокринного ростового фактора - IL-2 и его рецептора, а точнее a-цепи этого рецептора, обеспечивающей достижение необходимого уровня сродства к цитокину, что служит условием выполнения рецептором его функций. Оба эти гена являются индуцибельными, т.е. в покоящемся состоянии они выключены, но экспрессируются в ответ на индуцирующее воздействие. Сигнал к включению гена поступает из его регуляторного (промоторного) участка, в котором расположены сайты специфического взаимодействия с определенными белками - транскрипционными факторами. Некоторые их таких белков исходно представлены в клетке в активной форме, но большинство отсутствует и может быть синтезировано de novo или активировано путем фосфорилирования или удаления ингибирующей субъединицы. Таким образом, молекулярная основа активации - образование необходимых транскрипционных факторов, обеспечивающих включение индуцибельных генов.
На Т-лимфоциты активирующее воздействие оказывают индукторы активации. В физиологических условиях таким индуктором служит антигенный стимул. Само по себе распознавание антигена при контакте Т-хел- пера с АПК не может повлиять на активность гена в силу пространственной разобщенности мембранного рецептора и генов, локализующихся в ядре. TCR проникает внутрь клетки после связывания с антигеном, но не для того, чтобы мигрировать в ядро и повлиять на активность гена, а для того, чтобы быть расщепленным. Однако при связывании антигенного комплекса с TCR в сочетании с костимулирующим воздействием возникает сигнал, достигающий ядра и регулирующий экспрессию генов. Передача сигнала осуществляется по каскадному принципу. На разных этапах передачи сигнала ее осуществляют молекулы ферментов (главным образом, протеинкиназы, активирующие белки на каждой очередной стадии передачи сигнала), а также адапторные и ГТФ-связывающие белки. Сигнал исходно является двойственным, поскольку его передача осуществляется одновременно от TCR и CD28. Затем эти пути пересекаются и вновь разделяются на несколько ветвей. Конечный результат передачи сигнала по каждому сигнальному пути - формирование транскрипционного фактора. На рис. 3.90 представлена типовая схема внутриклеточной передачи сигнала, завершающейся формированием транскрипционных факторов и активацией генов. Для активации Т-клеток требуется формирование трех транскрипционных факторов - NF-AT, NF-kB и AP-1. Далее рассмотрим осуществление внутриклеточной передачи сигнала на примере активации Т-хелперов при распознавании презентируемого дендритными клетками антигена.
Связывание комплекса MHC-II-пептид вызывает конформационные изменения молекулы TCR и связанной с ней молекулы корец ептора CD4. Пока окончательно не известно, происходит ли при этом только изменение конформации рецепторов или они олигомеризуются. Такие изменения активируют тирозинкиназы, ассоциированные с рецептором и корецеп- тором - Lck (p56lck), связанную с CD4, и Fyn (p59fyn), связанную с CD3. Указанные тирозинкиназы называют рецепторными, или проксимальными, в связи с тем, что они непосредственно примыкают к рецептору, входя в рецепторный комплекс. Обе упомянутые киназы относят к семейству Src-киназ. Киназы этого семейства содержат домены SH1, SH2 и SH3 (SH - от Src-homology) (рис. 3.91). Первый домен обладает ферментативной активностью, остальные взаимодействуют с другими киназами и адапторными белками. Функция тирозинкиназ состоит в фосфорилировании по остатку тирозина белков-мишеней, что необходимо для их активации и проявления функций, в том числе ферментативных. Мишени рецепторных киназ многочисленны. К ним относят сами молекулы Fyn и Lck (что обусловливает их аутофосфорилирование), а также полипептидные цепи TCR и другие киназы. Особенно многообразны мишени киназы Lck.
Однако первоначальным условием активации рецепторных киназ является, наоборот, их дефосфорилирование, обеспечивающее пере-

ход из гиперфосфорилированного в нормальное состояние. Дело в том, что в покоящейся клетке SH2-домен киназы Lck находится в свернутой форме вследствие фосфорилирования С-концевого остатка тирозина Y505 конститутивно активированной киназой Csk. Фосфорилированный Y505 взаимодействует с помощью фосфатной группы с остатком тирозина в Sffi-домене, к которому и подтягивается С-конец молекулы. В таком виде фермент не активен, поскольку при этом не может быть фосфори- лирован функционально важный остаток Y394 в домене SH1. Для снятия такой функциональной блокады необходимо дефосфорилирование с последующим развертыванием молекулы, что осуществляется с участием тирозинфосфатаз. Основную роль в переводе рецепторных киназ в «рабочее» состояние выполняет молекула CD45, цитоплазматический домен которой обладает активностью тирозинфосфатазы. Ранее уже упоминалось, что эта крупная молекула, препятствующая формированию тесного контакта между дендритной клеткой и Т-хелпером, вначале удаляется из зоны иммунного синапса, а затем часть молекул возвращается в эту зону для выполнения своей функции - дефосфорилирования молекул рецепторных тирозинкиназ. После того как остаток Y394 становится доступным для фосфорилирования, Lck может проявлять активность тирозинкиназы.
В генерации сигналов, передаваемых от полипептидных цепей комплекса TCR-CD3, наиболее важно наличие в цитоплазматическом участке у-, 5-, е- и Z-цепей активационной последовательности ITAM, о которой уже неоднократно упоминалось. Структура этого мотива такова: YXXI/L/ VX(6-8)YXXI/L/V (где Y - тирозин, Х - любой остаток, I/L/V - изолейцин, лейцин или валин) (рис. 3.92). Фосфорилирование остатков тирозина

Рис. 3.92. Сопоставление характеристик активационных и ингибирующих мотивов (ITAM и ITIM)

в ITAM делает этот участок доступным для распознавания аналогичными участками сигнальных молекул, расположенных более дистально. Среди полипептидных цепей TCR наиболее важна для передачи сигнала Z-цепь. В отличие от у-, 5- и е-цепей TCR, имеющих по одному участку ITAM, в цитоплазматической части Z-цепи расположены 3 последовательности ITAM, предназначенные для взаимодействия с остатками тирозина тирозинкиназы ZAP-70 (от Z-associated protein - ^-ассоциированный белок; масса 70 кДа) - ключевого фактора в передаче сигнала от TCR при его связывании с лигандом. Фосфорилирование Z-цепи является наиболее ответственным и в то же время наиболее уязвимым этапом активации Т-клеток. Полагают, что именно для обеспечения фосфорилирования всех мотивов ITAM этой молекулы необходимо длительное поддержание контакта Т-лимфоцитов и дендритных клеток. В Z-цепи покоящейся Т-клетки фосфорилирован 1 остаток тирозина; отсутствие фосфорилирования приводит к развитию апоптоза (рис. 3.93). После взаимодействия Z-цепи и ZAP-киназы запус-

Рис. 3.94. Схема сигнальных путей при активации Т-клеток. Распознавание комплекса молекулы МНС с антигенным эпитопом в сочетании с костимуляцией индуцирует запуск сигналов, передаваемых в ядро с помощью 5 каскадов, обеспечивающих формирование 3 транскрипционных факторов, необходимых для активации клетки. Жирным контуром обведены факторы, для которых показана высокая степень зависимости от костимуляции

кается полномасштабный процесс в виде нескольких параллельных путей передачи активационного сигнала (рис. 3.94).
Молекулу ZAP-70 относят к тирозинкиназам семейства Syk. Она содержит тандем из двух SH2-доменов. Условие ее взаимодействия с фцепью - предварительное фосфорилирование остатков тирозина в ITAM фцепи. После фосфорилирования 2-й остаток тирозина в мотивах ITAM фцепи взаимодействует с тирозином S^-доменов киназы ZAP-70. В результате фосфатная группа тирозина фцепи становится общей с тирозином Sffi-домена молекулы ZAP-70. За этим следует фосфорилирование остатков тирозина в ферментативном домене молекулы ZAP-70, осуществляемое тирозинкиназами Lck и, возможно, Fyn, что приводит к включению ферментативной (киназной) активности молекулы.
Дальнейшая передача сигнала обусловлена взаимодействием ZAP-70 с ее главным субстратом - адапторным белком LAT (от Linker for activation of T-cells - линкер активации Т-клеток). Этот белок связан с мембраной и входит в состав рафтов. После катализируемого ZAP-70 фосфорилирования LAT приобретает способность связывать сигнальные молекулы, участвующие в дальнейшей передаче сигнала: адапторные белки SLP-76, Grb2, фактор Vav, а также ферменты - PLCy1 и PI3K. Активация некоторых из упомянутых белков зависит от LAT не напрямую, а косвенно. Так, через SH3-домены

адапторных белков семейства Grb2 к сигнальному пути подсоединяются факторы SLP-76 и Sos. SLP-76, в свою очередь, опосредует подключение к сигнальному пути PLСy1 и ГТФазы Ras. Активация PLCy1 происходит с участием тирозинкиназы Itk, относящейся к семейству Btk - третьему (после Src и Syk) семейству тирозинкиназ, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала при активации лимфоцитов. Все сигнальные факторы, вовлекаемые в процесс активации с прямым и косвенным участием LAT, рекрутируются в состав клеточной мембраны и взаимодействуют с ее фосфоинозитидными компонентами. Комплекс, образуемый при взаимодействии SLP-76, Vav и Nck, реагирует с белками цитоскелета PAK и WASP, служащими медиаторами перестроек в цитоскелете активируемых клеток.
Активированная PLCy1 катализирует расщепление фосфатидилино- зитол 4,5-бифосфата с образованием диацилглицерола (DAG), который остается связанным с мембраной, и инозитол-1,4,5-трифосфата (рис. 3.95). Инозитол трифосфат поступает в цитоплазму и взаимодействует с рецепторами на поверхности эндоплазматического ретикулума, что обусловливает выход ионов Са2+ из внутриклеточных хранилищ. Опустошение последних вызывает открытие Са2+-зависимых каналов в клеточной мембране, через которые в клетку поступают ионы Са2+ из внеклеточного пространства. В результате возрастает концентрация свободных ионов Са2+ в цитоплазме клетки. Ионы Са2+ активируют фосфатазу кальциневрин, дефосфорилиру- ющую цитоплазматический компонент транскрипционного фактора NF-AT (Nuclear factor of activated T-cells - ядерный фактор активированных Т клеток) (рис. 3.96). Это обусловливает перемещение фактора в ядро, взаимодействие с ядерным компонентом и формирование зрелой формы молекулы NF-AT, способной взаимодействовать с ДНК в промоторных участках генов, вовлеченных в активацию Т-клеток (IL2, IL2R и др.).
Диацилглицерол традиционно рассматривали как фактор, активирующий протеинкиназу С (PKC) - уже не раз упоминавшуюся ранее серин/тре-

Рис. 3.96. Са2+-зависимое звено активации Т-клеток и его блокада циклоспорином А. Зависимый от инозитолтрифосфата сигнальный путь приводит к мобилизации в ядро транскрипицонного фактора NF-AT. Этот путь может быть блокирован циклоспорином А, способным в комплексе с циклофиллином инактивировать фосфатазу кальциневрин, ответственную за дефосфорилирование цитоплазматического фактора NF-AT (что служит условием его миграции в ядро)

ониновую киназу, признаваемую одним из ключевых факторов активации Т-клеток. Однако оказалось, что изоформы РКС, активируемые диацил- глицеролом, не имеют отношения к активации Т-клеток. В ней участвует изоформа 0 РКС, появляющаяся в иммунном синапсе на пике его «зрелости». Ее рекрутирование в иммунный синапс зависит от активности Р13К и Vav (последний фактор связан с цитоскелетом, роль которого в транспорте РКС0 очень важна). Поскольку активация Vav зависит от сигнализации не только через TCR, но и через CD28, а CD28-зависимый путь реализуется с участием PI3K (она ассоциирована с CD28 - см. далее), становится очевидным, что PI3K и Vav представляют различные этапы одного сигнального пути и, таким образом, вовлечение в активацию молекулы РКС0 зависит от костимуляции через CD28. При этом не вызывает сомнений роль в активации РКС0 сигналов, поступающих от TCR, поскольку РКС0 фосфорили- руется (и, следовательно, активируется) киназой Lck. Допускают участие в активации РКС0 и других факторов, в том числе диацилглицерола, но эти влияния второстепенны. Активация PKC0 необходима для предотвращения апоптоза активируемых клеток и включения двух из трех критических транскрипционных факторов, необходимых для экспрессии генов IL2 и IL2R - АР-1 и NF-kB. РКС0-зависимая активация АР-1 реализуется через Rac/JNK-ветвь MAP-каскада (о нем будет сказано далее). Путь, приводящий к активации транскрипционного фактора NF-kB, содержит в качестве

промежуточных звеньев последовательно активируемые (с участием PKC0) факторы CARMA-1, Bcl-10 и MALT-1, IKK. IKK фосфорилирует ингибирующую субъединицу NF-kB - IkK, придавая ей способность к связыванию убиквитина, что предопределяет ее последующую деградацию. При этом освобождается активная субъединица NF-kB, мигрирующая в ядро и выступающая в роли транскрипционного фактора - одного из трех, необходимых для экспрессии генов активации Т-клеток. Транскрипционный фактор NF-kB, играющий ключевую роль при активации клеток врожденного иммунитета, был рассмотрен выше (см. раздел 2.2.4).
Столь же широко при активации клеток используется еще один сигнальный путь, запускаемый при активации Т-лимфоцитов - MAP-каскад, или MAP-модуль (от Mitogen-activated kinases - киназы, активированные мито- геном). Его роль состоит главным образом в индукции транскрипционного фактора АР-1 (димера c-jun/c-fos). Существует 3 ветви этого каскада, приводящие к образованию трех типов MAP-киназ (MAP^ - ERK1/ERK2 (от Extracellular signal-regulated kinases - киназы, регулируемые внеклеточными сигналами), p38 и JNK (от c-Jun NH2-terminal kinases - c-Jun NH2-концевые киназы). Каскады, приводящие к активации MAP-киназ, включаются с участием адапторных белков и низкомолекулярных ГТФаз. Один из адап- торных белков - Grb2 (Growth factor receptor bound protein 2), активируется при взаимодействии с фактором LAT. Активированный Grb2 спонтанно связывается с другим LAT-активированным белком SLP-76 и фактором Sos (от Son of sevenless). Sos представляет фактор замещения гуаниннуклеотидов: он обусловливает замещение ГДФ на ГТФ в составе малых G-белков (т.е. белков, связывающих гуаниннуклеотиды). Поэтому комплекс SLP-76/Grb2/Sos обусловливает активацию G-белка Ras, превращая связанный с ним ГДФ в ГТФ. Ras-ГТФ активирует серин/треониновую киназу Raf (киназу киназы MAP-киназы - МККК). Далее следует каскад реакций: Raf активирует МЕК (киназу MAP-киназы - МКК), а МЕК активирует вышеупомянутые MAP-киназы ERK1 и ERO. Активацию JNK-ветви MAP-каскада инициирует упоминавшийся выше фактор Vav (зависимый от LAT и связанный с активацией цитоскелета, а также РКС0, см. выше). Он вызывает переход ГДФ в ГТФ в комплексе с G-белком Rac (семейство Rho). Rac-ГТФ активирует киназу МЕКК (выступающую в роли МККК), она активирует киназу JNKK (MKK), которая, в свою очередь, активирует MAP-киназу JNK. Третий путь MAP-модуля, приводящий к образованию MAP-киназы р38, также зависит от G-белков семейства Rho. Он аналогичен по общей схеме двум другим путям, но изучен менее детально.
Активация MAP-киназ ERK1/ERK2, JNK и p38 осуществляется путем фосфорилирования остатков треонина и тирозина в мотиве TXY, причем роль Х в трех типах киназ выполняют различные остатки (соответственно Glu, Pro и Gly). Названные MAP-киназы обусловливают формирование транскрипционных факторов, участвующих во многих клеточных процессах. ERK1/ERK2 обусловливает образование транскрипционных факторов АР-1 и Elk-1, JNK - факторов ATF2, Elk-1 и c-Jun (компонент АР-1), p38 - факторов ATF2, Elk-1 и MEF-2C.
Запуск рассмотренных выше сигнальных путей при активации Т-клеток происходит при параллельном связывании TCR и костимуляции через молекулу CD28. Дифференцирование сигнальных путей, включаемых через эти мембранные молекулы, а также расшифровка взаимодействия этих путей до конца не завершены. Однако общая картина проявляется достаточно четко, чтобы в общих чертах понять молекулярные основы костимуляции. При связывании TCR, координированном со связыванием корецептора, происходит изменение конформации комплекса TCR-CD3, CD4 вызывает активацию рецепторных тирозинкиназ Fyn и Lck, а также фосфатазы CD45. Конечный результат «проксимальных» событий - фосфорилирование Z-цепи рецепторного комплекса и передача активационного сигнала на киназу ZAP-70. Далее с участием адапторных белков LAT, SLP-76 и Vav область, вовлеченная в передачу сигнала, существенно расширяется, включая мембранно-связанные киназы, цитоскелет и малые G-белки. Сигнальный путь, приводящий (через активацию PLCyl, образование инозитолтрифосфата и активацию кальциневрина) к мобилизации Са2+ и активации транскрипционного фактора NF-AT, по-видимому, реализуется без прямого участия сигналов, генерируемых при костимуляции. Другие пути в большей или меньшей степени зависят от костимулирующего сигнала.
Наиболее прямое следствие костимуляции через CD28 - активация мембранного фермента PI3K, физически связанного с молекулой CD28. Этот фермент катализирует образование фосфатидилинозитол 4, 5-бифосфата, служащего источником инозитолтрифосфата. Однако это событие напрямую не связано с активацией и может рассматриваться как подготовительное. При активации клетки фосфатидилинозитолтрифосфат активирует Vav - узловой фактор, ответственный за вовлечение в процесс активации цитоскелета и участвующий в рекрутировании и активации протеинкиназы PKC0. Этот фермент важен для функционирования сигнального пути, приводящего к формированию транскрипционных факторов NF-kB и АР-1. В обоих случаях роль PKC0 в наибольшей степени проявляется во включении Rас/JNK-ветви MAP-каскада. Raf/ERK- и Rac/p38-ветви MAP-каскада в меньшей степени зависят от PKC0, а следовательно, от костимуляции. Таким образом, молекулярная основа костимуляции - вовлечение в процесс активации Т-хелпера сигнальных путей, реализуемых с участием трех ключевых факторов - PI3K, фактора Vav и изоформы 0 протеинкиназы С. Из трех ключевых транскрипционных факторов, запускающих гены активации Т-клеток, экспрессия двух (АР-1 и NF-kB) зависит от костимуляции и только для выработки NF-AT непосредственно костимуляция не требуется.
Таким образом, в результате в Т-клетке формируется 3 транскрипционных фактора - NF-AT, NF-kB AP-1. Формирование этих факторов происходит различными путями. Активный NF-AT образуется в результате сборки димера, включающего цитоплазматический и ядерный субкомпоненты NF-AT - NF-ATc и NF-ATn. Если NF-ATn - конститутивный фактор, всегда присутствующий в ядре Т-клетки, NF-ATc должен быть активирован для миграции в ядро, что достигается его дефосфорилированием, катализируемым кальциневрином (см. выше). Транскрипционный фактор NF-kB активируется путем отщепления от комплекса IkB-NF-kB ингибирующей субъединицы IkB. Как уже говорилось выше, это происходит при фосфорилировании IkB киназой IKK, активируемой с участием РКС0. Фосфорилированная субъединица становится доступной для деградации

по убиквитиновому пути. Фактор АР-1 - димер белковых продуктов двух индуцибельных протоонкогенов - c-fos и c-jun. Для экспрессии этих генов и синтеза белков необходимы соответствующие транскрипционные факторы, а именно Elk-1 (для c-fos) и JNK (для c-jun). Как уже было указано выше, Elk-1 и JNK - конечные продукты деятельности различных ветвей MAP-каскада. Синтезируемые de novo белки c-fos и c-jun образуют гомо- и гетеродимеры, формирующие транскрипционный фактор АР-1.
Рассмотренные три фактора (NF-AT, NF-kB и AP-1) нужны для индукции генов активации Т-клеток - в первую очередь IL2 и IL2R. Промоторный участок гена IL2 содержит 9 сайтов связывания транскрипционных факторов (рис. 3.97). Среди них есть 2 участка связывания октомера Oct, не лимитирующего процесс индукции гена. Из трех ключевых транскрипционных факторов NF-kB взаимодействует с промотором в одном сайте, не зависимом от других транскрипционных факторов. Два других фактора - NF-AT и AP-1 - взаимодействуют с промотором как отдельно друг от друга (по 1 сайту связывания), так и в комплексе (3 сайта связывания). Заполнение всех сайтов соответствующими транскрипционными факторами, приводящее к индукции гена, служит конечным результатом передачи сигнала при активации Т-клеток.
Выше были подробно рассмотрены сигнальные пути, участвующие в активации Т-хелперов. Активация цитотоксических Т-клеток осуществляется по сходным механизмам.
3.5.2.2. Проявления активации Т-клеток
Активация CD4+ Т-клеток (как и любых Т-лимфоцитов) приводит к экспрессии большого числа генов, среди которых наибольшую роль в реализации основных эффекторных событий играют гены IL2 и IL2R, кодирующие соответственно цитокин IL-2 и a-цепь его рецептора. Экспрессия гена IL2 происходит примерно через 1 ч после получения стимулирующего сигнала. Секрецию белка IL-2 стимулированными Т-клетками in vitro выявляют через 3-4 ч; она достигает пика через 8-12 ч и прекращается через 24 ч. In vivo секреция IL-2 начинается через 1-3 сут после введения антигена

Рис. 3.98. Временная динамика экспрессии молекул активации Т-клеток. На графи
ке представлены сроки экспрессии ключевых молекул активации после стимуляции Т-клеток

(иммунизации) и сохраняется в течение 7-12 сут. Экспрессия a-цепи рецептора IL-2 происходит несколько позже и продолжается дольше - in vitro ее выявляют через 4 ч после стимуляции; максимума она достигает через 2-3 сут и прекращается через 5 сут (рис. 3.98).
Одновременно с геном IL2 в кратчайшие сроки после действия стимулятора (в физиологических условиях - антигенного комплекса пептид-MHC) экспрессируются гены с-Myc и N-Myc, называемые ранними активационными генами. Они участвуют в подготовке клеток к митозу. Через 2-3 ч на поверхности Т-клетки появляется CD69 - самый ранний активационный антиген, частично мобилизуемый из внутриклеточных депо, а частично экспрессируемый de novo. Его экспрессия продолжается немногим более суток. Вскоре после CD69 на поверхности клетки появляется другой ранний маркер активации - CD25, представляющий уже упомянутую a-цепь рецептора для IL-2. Несколько раньше выявляют экспрессию ряда цитоки- новых генов и синтез ограниченных количеств соответствующих цитокинов (IFNy, IL-4, IL-5, IL-6).
Следующие проявления активации наблюдают через сутки после действия стимулятора, когда экспрессируется молекула рецептора для транс- феррина (CD71). Этот фактор играет важную роль в пролиферации, поскольку для ее осуществления необходимы ионы железа. В последующие дни (3-6 сут) экспрессируются молекулы MHC-II, относимые к поздним маркерам активации Т-клеток, а затем - р1-интегрины, обозначаемые как очень поздние активационные антигены - VLA (Very late activation antigens), и секретируются хемокины. Эти поздние проявления активации клеток совмещаются с пролиферативным процессом.

2981 0

Активация Т- и В-клеток, которые экспрессируют подходящие рецепторы, завершается пролиферацией - увеличением численности (экспансией) лимфоцитарного клона - и дальнейшей дифференцировкой в эффекторные клетки; небольшое количество размножившихся клеток станет клетками памяти. Однако эффекторные функции Т- и В-клеток совершенно различны.

Активация и дифференцировка Т-клеток приводят к синтезу и выделению ряда цитокинов, воздействующих на множество различных типов клеток, или, наоборот, к развитию эффекторных клеток, которые об ладают прямым цитотоксическим действием на клетки хозяина. Напротив, активация и дифференцировка В-клеток приводят к образованию антител. В этой главе более детально описано, как активируются и исполняют свои эффекторные функции Т- и В-клетки.

Активация СD4+-Т-клеток

СD4+-Т-клет-ки, которые играют ключевую роль при ответах почти на все белковые антигены, активируются экзогенными антигенами. Вначале рассмотрим, как эти экзогенные антигены захватываются в организме антигенпрезентирующими клетками (АПК) и как впоследствии АПК взаимодействуют с CD4+-T-клетками.

Специализированные клетки, представляющие антиген Т-клеткам

Антиген может попасть в организм разными путями. В этих участках вторжения антигена находятся специализированные, или профессиональные, АПК - особенно в дыхательных путях, ЖКТ и коже, а также в лимфоидных органах и других тканях по всему телу. Наиболее важными из них являются клетки, производные миелоидного ростка костного мозга, - дендритные клетки и макрофаги. Функциями АПК являются захват антигена, его процессинг и презентация Т-клеткам, а также обеспечение костимуляторными сигналами, которые активируют наивные Т-клетки.

Дендритные клетки - это гетерогенное семейство клеток, которые можно обнаружить во многих тканях, включая тимус. Эти клетки необходимы для инициации ответа первичных, или наивных, Т-клеток, т.е. при первой активации Т-клеток чужеродным антигеном. Для эффективного функционирования дендритных клеток в качестве АПК необходимы многие свойства: они коститутивно экспрессируют высокие уровни МНС II класса (а также и I класса).

Кроме этого дендритные клетки очень подвижны, быстро перемещаются из мест, где вошли в контакт с антигеном, в лимфатические узлы , в которых смогут взаимодействовать с Т-клетками. Более того, захват и процессинг дендритными клетками антигенов, в частности микробных возбудителей, индуцируют костимуляторные сигналы, которые необходимы для активации наивных Т-клеток. Далее эти свойства описаны более детально.

Рис. 10.1. Созревание дендритной клетки после взаимодействия с бактерией в ткани

На рис. 10.1 показано, что взаимодействие антигена с дендритной клеткой в ткани определяет ее созревание, приводящее в конечном счете к тому, что несущая антиген клетка выходит из ткани в лимфатический узел, дренирующий этот участок. Антиген, показанный на рисунке, - грамотрицательная бактерия, захватывается незрелой дендритной клеткой в ткани. Бактерия взаимодействует с Toll-подобным рецептором (TLR) , который экспрессирует дендритная клетка.

Семейство TLR является паттернраспознающими молекулами, экспрессирующимися на клетках врожденной иммунной системы. Они взаимодействуют с инфекционным микроорганизмом или его компонентами: отдельными бактериальными продуктами, такими как ДНК, липопротеин и липополисахарид. Некоторые TLR взаимодействуют с различными бактериальными компонентами, тогда как другие, как предполагается, - с вирусными продуктами. Клеточная стенка грамотрицательной бактерии содержит липополисахарид и взаимодействует с TLR-4, экспрессирующимся на дендритной клетке. Это взаимодействие, связанное с захватом бактерии в клетку, активирует феномен.

Белковые компоненты бактерии процессируются до пептидов в вакуолях с кислым содержимым по пути МНС II класса. На клеточной поверхности появляется большое количество костимулирующих молекул семейства В7 (CD80/CD86), концентрация молекул МНС II класса также возрастает. Дендритная клетка тоже синтезирует высокие концентрации хемокинов и провоспалительных цитокинов, которые являются растворимыми факторами, увеличивающими или вызывающими воспалительный ответ в тканях. К этим цитокинам относят фактор некроза опухоли (TNF) а и IL-12.

Таким образом, дендритная клетка, содержащая поцессированные пептиды, покидает ткань, в которой встретилась с антигеном, и мигрирует по лимфатическим сосудам в лимфатический узел, дренирующий эту ткань. (Миграция из ткани ассоциирована с повышением экспрессии дендритными клетками хемокинового рецептора CCR7.) В Т-клеточной области лимфатического узла уже зрелая дендритная клетка, экспрессирующая высокие уровни МНС II класса и костимулирующих молекул, презентирует пептиды наивной CD4+-T-клеткe, экспрессирующей Т-клеточный рецептор, специфичный для особой комбинации МНС и пептида.

Заметим, что при отсутствии сигнала, индуцированного антигеном, незрелые дендритные клетки экспрессируют низкие концентрации костимулирующих молекул. Таким образом, антигены, не индуцирующие высокие уровни костимулирующих функций, не активируют наивные Т-клетки. Вот почему встреча дендритной клетки с собственными молекулами в нормальной ткани не приводит к активации этой клетки или Т-клеток - поскольку не индуцируется костимулирующая функция

Сходным образом для Т-клеточного и антительного ответов на многие «безвредные» антигены (например, белок куриного яйца, введенный мыши) необходимо присутствие адъюванта - такого как полный адъювант Фрейнда - который включает бактерии или бактериальные компоненты. Бактериальные компоненты адъюванта используются для активации АПК, в особенности для экспрессии костимулирующих молекул. В отсутствие этого добавочного сигнала даже чужеродный антиген может вызвать низкий ответ или вообще его не вызвать.

Миграция АПК, несущих антиген в дренирующий узел, сочетается со способностью наивных Т-клеток рециркулировать по лимфатическим сосудам в лимфатические узлы. Это увеличивает вероятность того, что единичный Т-лимфоцит, экспрессирующий подходящий TCR (по приблизительной оценке это примерно один из общей популяции, составляющей 105-106 клеток), взаимодействует с АПК, несущей антиген. В самом деле, исследования свидетельствуют, что это взаимодействие происходит в организме в течение нескольких часов после введения антигена.

Взаимодействие несущих антиген АПК и Т-клеток - особенно активированных и Т-клеток памяти - может происходить в любой ткани, зараженной или поврежденной антигеном. Каскад событий, развивающихся после того, как АПК в соединении с пептидом взаимодействует с СD4+-Т-клеткой, описывается далее.

Парные взаимодействия на поверхности АПК и CD4+-T-клетки

Пептид/МНС и TCR

Взаимодействие комплекса пептид-молекула МНС II класса, экспрессированного на АПК, и вариабельных областей Vα + Vβ TCR на Т-клетке называют первым сигналом Т-клеточной активации. Это взаимодействие необходимо, но в основном недостаточно для Т-клеточной активации, особенно для активации наивных СD4+-Т-клеток, вследствие низкой склонности к взаимодействию между TCR и комплексом пептид-МНС.

Главный комплекс гистосовместимости II класса и CD4

Взаимодействие неполиморфного участка молекулы МНС II класса (т.е. вне связывающей пептид полости) с дополнительным рецептором CD4 значительно повышает способность Т-клетки отвечать на антиген. Показано, что взаимодействие CD4-МНС II класса делает клетку в 100 раз более чувствительной к антигену, чем при его отсутствии. Рецептор CD4 играет важную роль в трансдукции Т-клеточного сигнала.

Рис. 10.2. Ключевые взаимодействия клеточных поверхностей, ведущие к активации Т-клеток и секреции цитокинов. Штриховкой указана экспрессия, повышающаяся при активации

Предполагается, что после того как комплекс пептид-МНС свяжется с TCR, CD4 приближается к TCR, и цитоплазматический хвост CD4, связанный с ферментом, участвует в Т-клеточной активации; «группирование» CD4 с TCR добавляет этот фермент в комплекс, формирующийся для передачи сигнала.

Костимулирующие пары: В7 с CD28 или CD152, CD40 с CD154

Костимулятор, или второй сигнал, усиливает и поддерживает сигналы, образовавшиеся при взаимодействии МНС - пептид - TCR. Костимуляторы необходимы для активации наивных (непримированных) Т-клеток, но менее важны для активации ранее примированных Т-клеток.

Наиболее изучены костимуляторные взаимодействия между семейством молекул, названным В7, которые экспрессируются на профессиональных АПК (таких как дендритные клетки, макрофаги и активированные В-лимфоциты), и CD28, конститутивно экспрессируемыми на Т-клетках. Больше всего известно о молекулах CD80 и CD86 семейства В7 (В7.1 и В7.2 соответственно); обе связываются с CD28. В настоящее время не ясно, обладают ли CD80 и CD86 разными функциями. Они также взаимодействуют с другой молекулой на Т-клеточной поверхности - CD152 (называемой CTLA-4), которая индуцируется при Т-клеточной активации. Молекула CD152 относится к тому же семейству молекул, что и CD28, но играет в активации Т-клеток другую роль. Костимуляторные функции других молекул семейств В7 и CD28 в настоящее время уточняются.

Взаимодействие комплекса пептид-МНС с TCR также усиливает экспрессию CD154 (лиганд CD40-CD40L) на Т-клетке. Молекула CD154 взаимодействует с CD40, постоянно экспрессируемой АПК, такими как дендритные клетки и макрофаги, а также В-клетками. Взаимодействие CD40-CD154 вызывает повышение экспрессии В7 на поверхности АПК и таким образом усиливает взаимодействие В7-CD28 между АПК и Т-клеткой. Взаимодействие CD154 на активированной Т-клетке с CD40, экспрессируемой на В-клетке, играет ключевую роль во взаимодействии Т- и В-клеток.

Молекулы адгезии: CD54 с CD11a/CD18, CD58 с CD2

Две пары адгезивных взаимодействий усиливают и стабилизируют взаимодействие АПК и Т-клетки на несколько часов, которые клеткам необходимо провести в контакте для активации Т-лимфоцита. Первое взаимодействие осуществляется между CD54 (молекула межклеточной адгезии 1; intercellular adhesion molecule 1 - ICAM-1), экспрессируемой на АПК, и интегрином CD11a/CD18 (антиген, связанный с функционированием лейкоцитов 1; leukocyte function-associated antigen 1 - LFA-1), экспрессируемым на Т-клетке.

Второе взаимодействие осуществляется между CD58 (LFA-3), экспрессируемыми на АПК, и CD2, экспрессируемыми на Т-клетке. Кроме того, предполагается, что эти адгезивные взаимодействия замедляют отделение АПК от Т-клеток при первом взаимодействии; это обеспечивает необходимое время для сканирования TCR поверхности АПК в поисках подходящего комплекса МНС II класса - пептид.

Иммунологический синапс

По нынешним представлениям при взаимодействии АПК и пептида с СD4+-Т-клеткой формируется область межклеточного контакта, называемая иммунологическим синапсом. Кроме комплекса МНС-пептид и TCR, синапс формируют пары адгезионных молекул, описанные ранее, и молекулы В7-CD28 на поверхности Т-клетки и АПК. (Входит ли взаимодействие CD40 - CD154 в синапс, еще не решено.) Кроме того, со стороны Т-клетки синапс формируют сигнальные молекулы, рекрутируемые изнутри Т-клетки, и белки цитоскелета. Похоже, что синапс необходим для поддержания обмена сигналами между клетками, который продолжается, пока АПК и T-клетка не разойдутся после контакта длительностью около 8 ч.

Синапс динамично формируется и развивается; его состав и структура меняются с течением времени после первого контакта. Например, парные молекулы адгезии CD54 (ICAM-1) и CD11а/ CD18 (LFA-1) находятся в различных зонах синапса и появляются в разное время от момента первого контакта между клетками. Кроме того, другие молекулы включаются или исключаются из синапса спустя разное время от момента первого контакта.

Данные нескольких экспериментов свидетельствуют, что после активации Т-клетки реорганизуют свою структуру, как внутренний цитоскелет, так и клеточную мембрану. В мембране Т-клеток структура липидов негомогенна; они формируют так называемые микродомены, или липидные «плоты», обогащенные холестерином и гликосфинголипидами. При активации Т-клеток эти липидные «плоты», которые до этого были распределены по мембране, подтягиваются к синапсу и приносят с собой компоненты межклеточных сигналов. Это перемещение также выталкивает из зоны контакта молекулы, не вовлеченные во взаимодействие АПК с Т-клеткой.

Межклеточные события при активации СD4+-Т-клетки

Множество недавних исследований было посвящено идентификации последовательности активационных событий внутри СD4+-Т-клетки после первоначального контакта с АПК, экспрессирующей пептид, связанный с молекулой МНС II класса. Тем не менее все стадии этого сложного и взаимосвязанного процесса полностью не понятны, хотя определенно известно, что активационный каскад распространяется в определенном порядке от поверхности клетки через цитоплазму в ядро. Также известно, что некоторые события происходят за секунды, другие - через минуты, а некоторые - спустя часы после начала взаимодействия. Основные события при активации Т-клеток описаны на рис. 10.3.

Стартовый сигнал

Связывание комплекса МНС-пептид с внеклеточными вариабельными областями (Vα+Vβ) TCR приводит к передаче сигнала через плотно связанные молекулы CD3 и ξ внутрь Т-клетки. Природа передачи через мембрану в настоящее время еще не известна: возможно, она связана с агрегацией нескольких молекул TCR в мембране клетки (подобно первым шагам активации через В-клеточный рецептор, как будет описано далее) или с конформационными изменениями трансмембранной области цепей TCR.

Рис. 10.3. Внутриклеточные события при активации Т-лимфоцита. Для простоты показаны только по одной цепи CD3, ξ и один фосфорилированный ITAM. Оранжевые полукруги обозначают фосфатные группы, добавленные к активированной молекуле

Фосфорилирование киназ, сборка и активация сигнального комплекса на клеточной мембране

После связывания лиганда с TCR одним из первых событий, определяемых в Т-клетке через несколько секунд, является активация тирозиновых киназ - ферментов, которые активируют белки путем присоединения фосфатных групп к остаткам тирозина. Тирозинкиназы связаны с цитоплазматическими участками комплекса TCR и молекул CD4. (Предполагают, что мембранный белок CD45 - тирозиновая фосфатаза, активирует эти киназы, удаляя ингибирующие фосфатные группы). Тирозинкиназа, связанная с CD3 и называется Fyn, а тирозинкиназа, связанная с CD4, - Lck. Обе принадлежат к семейству тирозиновых киназ, известных Src (произносится как «сарк»).

Когда Fyn и Lck активированы, они группируются с областями CD3 и ξ-цепями, которые содержат описанные ранее иммунорецепторные тирозинсодержащие активационные мотивы (последовательности) (ITAM), и активируют их. Эта группировка (кластер) также подтягивает CD4, находящийся в тесной ассоциации с комплексом TCR, как описано ранее. Фосфорилированные последовательности ITAM в CD3 и ξ служат местом прикрепления еще одной тирозиновой киназы ZAP-70 (она принадлежит ко второму семейству тирозиновых киназ - Syk). Эту стадию считают ключевой для активации Т-клеток, поскольку у некоторых пациентов, у которых нет ZAP-70, Т-клетки не отвечают на антиген. Так как CD3 и ξ содержат множество ITAM-последовательностей, к этому комплексу сигнальных белков присоединяется более одной молекулы ZAP-70.

Тирозинкиназа, связанная с CD4, активирует ZAP-70, когда она уже присоединена к мультимолекулярному комплексу сигнальных белков. Активированная ZAP-70 фосфорилирует множество белков внутри клетки. Среди наиболее значимых субстратов активации ZAP-70 можно назвать адаптерные молекулы. Эти белки не обладают ферментативной активностью, но содержат множество участков для связывания с другими белками. Два типа этих важных адаптерных молекул, фосфорилированных после Т-клеточной активации, - LAT и SLP-76 - показаны на рис. 10.3.

Фосфорилированные адаптеры привлекаются к клеточной мембране, увеличивая тем самым комплекс молекул для транедукции сигнала, формирующийся в иммунологическом синапсе. Таким образом, на цитоплазматической стороне Т-клеточной мембраны собирается и активируется мультимолекулярный белковый комплекс, состоящий из молекул, последовательно передающих сигнал.

Активация внутриклеточных сигнальных механизмов

Активированные адаптерные молекулы, привлеченные в иммунологический синапс, связывают ферменты и другие адаптеры, активирующие некоторые важные внутриклеточные сигнальные пути. Адаптерные молекулы связывают фосфолипазу С-γ (PLC-γ), которая после фосфорилирования ZAP-70 катализирует разрушение мембранного фосфолипида фосфотидилинозитола дифос-фата (Р1Р2).

Он разделяется на два компонента: диацилглицерол (ДАГ), который активирует ассоциированный с мембраной фермент протеин-киназу С (РКС), активирующую киназный каскад, который приводит в конечном счете к активации в цитоплазме фактора транскрипции NF-kB, и инозитолтрифосфат (IР3), увеличивающий внутриклеточную концентрацию свободного кальция, который в свою очередь активирует цитоплазматическую молекулу кальциневрина, приводя к активации фактора транскрипции NF-AT. Этот механизм является клинически значимым, поскольку иммуносупрессант циклоспорин А, используемый для предотвращения отторжения трансплантата между генетически различающимися организмами, связывается с кальциневрином и посредством этого ингибирует следующие этапы Т-клеточной активации.

Также активированные адаптерные молекулы связываются и активируют связывающие нуклеотид гуанозин белки, называемые Ras и Rac, которые в свою очередь активируют цитоплазматический каскад митогенактивируемых протеинкиназ (mitogen-activated proteinkinases - MAP), ведущий к активации фактора транскрипции АР-1.

Секреция цитокинов и пролиферация

Как показано на рис. 10.3, NF-кВ, NF-AT, АР-1 и другие активированные факторы транскрипции поступают в ядро Т-клетки и избирательно связываются с регуляторными последовательностями различных генов. В результате гены, кодирующие цитокин IL-2 и одну цепь рецептора IL-2 (IL2Ra; CD25), транскрибируются и транслируются (рис. 10.4). IL-2Ra соединяется с другими цепями рецептора, формируя высокоаффинный рецептор для IL-2 на активированной Т-клетке. В течение 24 ч клетка увеличивается в размере (становится Т-клеточным бластом) и начинает секретировать белок IL-2.

Рис. 10.4. Секреция IL-2 и его взаимодействие с высокоаффинным IL-2-рецептором, приводящее к расширению СD4+-Т-клеточного клона

Интерлейкин-2 является фактором роста Т-клеток и связывается со своим высокоаффинным рецептором на этой же самой или другой Т-клетке. Спустя примерно 48 ч синтезируется ДНК, и приблизительно еще через 24 ч активированные CD4+-T-клетки начинают пролиферировать, что ведет к увеличению их количества в этом конкретном клоне Т-клеток. Некоторые из этих активированных клеток развиваются в СD4+-клетки памяти.

Роли B7-CD28 и B7-CD152 в активации Т-клеток

Ранее подчеркивалось значение взаимодействия членов семейства В7 с CD28 для усиления и поддержки сигнала от комплекса пептид-МНС и TCR на наивной СD4+-Т-клетке. Как уже было отмечено, считается, что при отсутствии костимуляторного сигнала В7 - CD28 наивная CD4+-Т-клетка не производит IL-2 и может оставаться инактивированной (анергичной).

Как взаимодействие В7-CD28 приводит к «полной» активации Т-клеток, пока не до конца понятно, но предполагают, что при этом задействуются несколько различных механизмов. Одним из важных путей является увеличение длительности жизни некоторых иРНК, в частности иРНК IL-2, в результате активации Т-клетки через CD28. Это приводит к увеличению синтеза белка IL-2 в Т-клетках, активированных как первым, так и вторым сигналом, по сравнению с клетками, активированными только через TCR. Результаты исследований также свидетельствуют, что сигнал от CD28 увеличивает жизнеспособность Т-клеток путем индукции экспрессии белка Вс1-х, который угнетает апоптоз.

Недавно полученные данные также указывают, что взаимодействие В7-CD28 мобилизует липидные плоты внутри Т-клетки; таким способом CD28 привлекает молекулы, такие как тирозиновые киназы, которые участвуют в активации Т-клеток, находясь внутри них, в месте, где TCR контактирует с АПК. Также было показано, что взаимодействие В7-CD28 активирует киназу, называемую фосфатидилинозитол-3-киназа; активация последующих этапов этого киназного пути, вероятно, усиливает внутриклеточную передачу сигнала, проводимого через TCR.

Ранее было указано на возможность контакта лигандов на поверхности АПК из группы В7 (CD80 и CD86) с поверхностной молекулой Т-клетки, родственной CD28, CD152 (называемой CTLA-4). В отличие от CD28, которая экспрессируется на покоящихся Т-клетках, экспрессия CD152 индуцируется вследствие активации Т-клетки.

Взаимодействие В7 с CD152 передает негативный сигнал в активированную Т-клетку. Он выключает продукцию IL-2 и, таким образом, пролиферацию Т-клеток, ограничивая длительность иммунного ответа. Механизм негативного эффекта, связанного с В7-CD152, полностью не ясен; как и при взаимодействии В7-CD28. вероятно, вовлечены множество биохимических механизмов. Последние данные позволяют предположить, что CD152 действует в иммунологическом синапсе путем замещения ключевых компонентов сигнального комплекса и/или ограничения их функций.

Миграция из лимфатического узла

Спустя несколько дней после первых активационных этапов, активированные Т-клетки и клетки памяти покидают лимфатический узел и направляются в различные участки организма, в частности в те, которые подвергались воздействию или были инфицированы патогенными микроорганизмами. Миграция из лимфатического узла связана со сменой экспрессии поверхностных клеточных молекул. В основном на активированных Т-клетках снижается экспрессия CD64L (L-селектина или MEL-14), рецептора хоминга наивных Т-клеток, который позволяет клеткам войти в лимфатический узел.

Активированные Т-клетки увеличивают экспрессию других молекул клеточной поверхности, таких как интегрин CD49dCD29 (VLA-4) и CD44. Лиганды к этим молекулам экспрессируются за пределами лимфатического узла в таких тканях, как кожа, или в очагах воспаления . Результаты недавно проведенных исследований также указывают, что активированные Т-клетки отличаются от наивных по экспрессии хемокиновых рецепторов. Таким образом, вследствие этой смены экспрессии молекул хоминга и хемокиновых рецепторов активированные Т-клетки и клетки памяти выходят из лимфатического узла и направляются в ткани.

Р.Койко, Д.Саншайн, Э.Бенджамини

Первым исследованием всегда является подсчет лейкоцитарной формулы (см. главу «Гематологические исследования»). Оцениваются как относительные, так и абсолютные значения количества клеток периферической крови.

Определение основных популяций (Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры) и субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-ЦТЛ). Для первичного исследования иммунного статуса и выявления выраженных нарушений иммунной системы ВОЗ рекомендовано определение CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить относительное и абсолютное количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки – CD3, В-клетки – CD19, натуральные киллеры (NK) – CD3- CD16++56+, субпопуляции Т лимфоцитов (Т-хелперы CD3+ CD4+, Т-цитотоксические CD3+ CD8+ и их соотношение).

Метод исследования

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится c использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным ангинам на клетках иммунной системы, методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточных цитофлуориметрах.

Выбор зоны анализа лимфоцитов производится по дополнительному маркеру CD45, который представлен на поверхности всех лейкоцитов.

Условия взятия и хранения образцов

Венозная кровь, взятая из локтевой вены, утром, строго натощак, в вакуумную систему до указанной на пробирке метки. В качестве антикоагулянта используется К2ЭДТА. После взятия пробирку с образцом медленно переворачивают 8-10 раз для перемешивония крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка строго при 18–23°С в вертикальном положении не более 24 ч.

Невыполнение этих условий приводит к некорректным результатам.

Интерпретация результатов

Т-лимфоциты (CD3+ клетки). Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вырусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний.

Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, при курении, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак.

В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижение наблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, лечении иммунодепрессантами, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки.

NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16++56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.

Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции.

Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.

Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.

Соотношение CD4+/CD8+ Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, ЦТЛ и их соотношение.

Диапазон значений – 1,2–2,6. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции (менее 0,7).

Увеличение значения более 3 – при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе.

Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и ЦТЛ у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться.

Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+HLA-DR+ Маркер поздней активации, показатель гиперреактивности иммунитета. По экспрессии данного маркера можно судить о выраженности и силе иммунного ответа. Появляется на Т-лимфоцитах после 3-го дня острого заболевания. При благоприятном течении заболевания снижается до нормы. Увеличение экспрессии на Т-лимфоцитах может быть при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением. Отмечено его повышение у пациентов с гепатитом С, пневмониями, ВИЧ-инфекцией, солидными опухолями, аутоиммунными заболеваниями.

ТNK-лимфоциты с фенотипом CD3+CD16++CD56+ Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры CD16++ CD 56+. Эти клетки имеют свойства как Т-, так и NK-клеток. Исследование рекомендовано как дополнительный маркер при острых и хронических заболеваниях.

Снижение их в периферической крови может наблюдаться при различных органоспецифических заболеваниях и системных аутоиммунных процессах. Увеличение отмечено при воспалительных заболеваниях разной этиологии, опухолевых процессах.

Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации. О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+). При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD8+CD38+ Присутствие CD38+ на ЦТЛ лимфоцитах отмечено у пациентов с разными заболеваниями. Информативный показатель при ВИЧ-инфекции, ожоговой болезни. Увеличение числа ЦТЛ с фенотипом CD8+CD38+ наблюдается при хронических воспалительных процессах, онкологических и некоторых эндокринных заболеваниях. При проведении терапии показатель снижается.

Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+ Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.

Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вырусных инфекциях.

Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.

Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.

Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.

Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.

Активированные лимфоциты CD3+CDHLA-DR+, CD8+CD38+, CD3+CD25+, CD95. Тест отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и рекомендован для контроля за течением заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях разной этиологии.