Окислительный метаболизм. Бактерии, об­ладающие окислительным метаболизмом, энергию получают путем дыхания.

Дыхание - процесс получения энергии в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донора­ми электронов могут быть органические (у органотрофов) и неорганические (у литотрофов) соединения, а акцептором - только неорганические соединения.
У бактерий, обладающих окислительным ме­таболизмом, акцептором электронов (или водорода (Н +)) является молекулярный кислород. В этом случае пируват полностью окисляется в цикле трикарбоновых кислот до С 2 . Цикл трикарбоновых кислот выполняет функции как поставщика предшественников для биосинтетических процессов, так и атомов водорода, который в форме восстановленного НАД пе­реносится на молекулярный кислород через серию переносчиков, обладающих сложной структурно оформленной мультиферментной системой - дыхательной цепью. Дыхательная цепь у бактерий локализована в ЦПМ и во внут­риклеточных мембранных структурах.
Переносчики, осуществляющие транспорт водорода (электронов) на молекулярный кислород, относятся к 4 классам дегидрогеназ, коферментами которых являются НАД, флавопротеины, хиноны и цитохромы. Протоны (электроны) передвигаются от одного носителя к другому в направлении увеличивающегося окислительно-восстановительного потенциала. Типичная цепь выглядит следующим образом:

ЦТК -> НАД(Н 2) -> флавопротеид -> хинон ---> цитохромы: в -> с --> а - O 2

Среди бактериальных цитохромов различа­ют цитохромы в, с, а и а 3 . Конечным этапом переноса электронов (протонов) по дыхательной цепи является восстановление цитохромов а - а3 (цитохромоксидазы). Цитохромоксидаза является конечной оксидазой, передающей электроны на кислород. В процессе переноса электронов по цитохромам меняется валентность входящего в состав железопорфирированной группы железа. Завершается перенос электронов реакцией O 2 + 4F 2+ 2О 2 + 4F 3+ . Образующиеся при окислении ФАД или хинонов протоны связываются ионами О 2 " с образованием воды.

Образование АТФ вдыхательной цепи связы­вают с хемоосмотическим процессом. Особая ориентация переносчиков в ЦПМ приводит к тому, что передача водорода происходит с внутренней на внешнюю поверхность мем­браны, в результате чего создается градиент атомов водорода, проявляющийся в наличии мембранного потенциала. Энергия мембранного потенциала используется для синтеза ло­кализованной в мембране АТФазой АТФ.

В это время у эукариотов ферменты дыха­тельной цепи имеют относительно постоян­ный состав, у бактерий встречаются вариации в составе дыхательной цепи. Так, у многих бактерий вместо убихинонов имеются нафтохиноны, состав цитохромов может зависеть от условий роста бактерий. У некоторых бакте­рий цитохромы отсутствуют, и при контакте с кислородом происходит непосредственный перенос водорода на кислород с помощью флавопротеидов, конечным продуктом при этом оказывается перекись водорода - Н 2 О 2 .

Помимо углеводов прокариоты способны использовать другие органические соедине­ния, в частности белки, в качестве источника энергии, окисляя их полностью до СО 2 и Н 2 О.

Аминокислоты и белки также могут высту­пать в качестве энергетических ресурсов. Их использование связано, в первую очередь, с определенными ферментативными преобразованиями подготовительного характера. Белки вначале вне клетки расщепляются протеолитическими ферментами на пептиды, ко­торые поглощаются клеткой и расщепляются внутриклеточными пептидазами до амино­кислот. Аминокислоты могут использоваться в конструктивном метаболизме, а могут у ам­монифицирующих бактерий служить основ­ным материалом в энергетических процессах при окислительном дезаминировании, в резуль­тате которого происходит выделение аммиака и превращение аминокислоты в кетокислоту, которая через цикл трикарбоновых кислот вступает в конструктивный метаболизм:

2R-CHNH 2 -СООН + O 2 -> 2R-СО-COOH + 2NH 3

Процесс аммонификации известен как «гниение», при этом происходит накопление продуктов, обладающих неприятным специ­фическим запахом образующихся при этом первичных аминов.

Гнилостные бактерии осуществляют мине­рализацию белка, разлагая его до СО 2 , NH 3 , H 2 S. К гнилостным бактериям относятся Proteus, Pseudomonas, Bacillus cereus.

Бродильный (ферментативный) метаболизм.

Ферментация, или брожение, - процесс получения энергии, при котором отщеплен­ный от субстрата водород переносится на органические соединения.

Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Ферментироваться могут углеводы, аминокислоты (за исключе­нием ароматических), пурины, пиримидины, многоатомные спирты. Не способны сбра­живаться ароматические углеводороды, стероиды, каротиноиды, жирные кислоты. Эти вещества разлагаются и окисляются только в присутствии кислорода, в анаэробных усло­виях они стабильны. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.

При ферментации гексоз (глюкозы) пируват лишь частично окисляется в цикле трикарбоновых кислот. Последний выпол­няет только функции поставщика предшественников для биосинтетических процессов. Энергия в форме 2 молекул АТФ образуется в результате субстратного фосфорилирования, протекающего при окислении триозофосфата в пируват. Отщепившийся от субстра­та водород, находящийся в форме восста­новленного НАД, переносится на пируват, превращая его в цепи реакций в этанол, кислоты, газы. Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов ферментации углеводов.

Спиртовое брожение. Встречается, в основ­ном, у дрожжей. Конечными продуктами яв­ляются этанол и СО 2 . Сбраживание глюко­зы происходит по ФДФ-пути в анаэробных условиях. При доступе кислорода процесс брожения ослабевает, на смену ему приходит дыхание. Подавление спиртового брожения кислородом называется эффектом Пастера.

Спиртовое брожение используется в пищевой промышленности: хлебопекарной, виноделии.

Молочнокислое брожение. Различают два ти­па молочнокислого брожения: гомоферментативное и гетероферментативное.

При гомоферментативном типе расщеп­ление глюкозы проходит по ФДФ-пути. Водород от восстановленного НАД переда­ется на пируват при помощи лактатдегидрогеназы, при этом образуется молочная кислота. Гомоферментативное молочно­кислое брожение происходит у S. pyogenes, E.faecalis, S. salivarius у некоторых видов рода Lactobacillus: L. dulgaricus, L. lactis.

Гетероферментативное молочнокислое бро­жение присутствует у бактерий, у которых от­сутствуют ферменты ФДФ-пути: альдолаза и триозофосфатизомераза. Расщепление глю­козы происходит по ПФ-пути с образовани­ем фосфоглицеринового альдегида, который превращается далее в пируват по ФДФ-пути ив последующем восстанавливается в лактат. Дополнительными продуктами этого типа бро­жения являются также этанол, уксусная кисло­та. Гетероферментативное молочнокислое бро­жение встречается у различных представителей бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium.

Продукты молочнокислого брожения игра­ют большую роль в формировании колонизационной резистентности бактериями рода Lactobacillus и Bifidobacterium, составляющих облигатную флору кишечника.

Молочнокислые бактерии широко исполь­зуются в молочной промышленности для получения молочнокислых продуктов, а также в создании пробиотиков.

Муравьинокислое (смешанное) броже­ние. Встречается у представителей семейств Enterobacteriaceae Vibrionaceae. Глюкоза рас­щепляется по ФДФ-пути, глюконат расщепляется по КДФГ-пути.

В зависимости от продуктов брожения, вы­деляющихся в анаэробных условиях, различа­ют два типа процессов:
1. В одном случае происходит расщепление пирувата с образованием ацетилкофермента А и муравьиной кислоты, которая, в свою очередь, может расщепляться на двуокись углерода и молекулярный водород. Другими продуктами брожения, образующимися через цепь реакций, являются этанол, янтарная и молочная кислоты. Сильное кислотообразование можно выявить реакцией с индикато­ром метил-рот, который меняет окраску в сильно кислой среде.
2. При другом типе брожения образуется це­лый ряд кислот, однако главным продуктом брожения являются ацетоин и 2,3-бутандиол. Ацетоин образуется из двух молекул пирувата с последующим двукратным декарбоксилированием. При последующем восстановлении ацетоина образуется 2,3-бутандиол. Эти вещества при взаимодействии аl-нафтол в щелочной среде вызывают образование окраски бурого цвета, что выявляется реакцией Фогеса-Проскауэра, используемой при идентификации бактерий.

Маслянокислое брожение. Масляная кислота, бутанол, ацетон, изопропанол и ряд других ор­ганических кислот, в частности уксусная, капро­новая, валерьяновая, пальмитиновая, являются продуктами сбраживания углеводов сахароли-тическими строгими анаэробами. Спектр этих кислот, определяемый при помощи газожид­костной хроматографии, используется как экс­пресс-метод при идентификации анаэробов.

Ферментация белков. Если для бактерий с бродильным метаболизмом источником энергии служат белки, то такие бактерии называ­ются пептолитическими. Пептолитическими являются некоторые клостридии, в частности С. histolyticum, С. botulinum. Пептолитические бактерии гидролизуют белки и сбраживают аминокислоты. Многие аминокислоты сбра­живаются совместно с другими, при этом од­на выполняет функцию донора, а другая фун­кцию - акцептора водорода. Аминокислота-донор дезаминируется в кетокислоту, которая в результате окислительного декарбоксилирования превращается в жирную кислоту.
5 классификация бактерий по отношению к кислороду. Особенности культивирования анаэробов.

Кислород, широко распространенный в при­роде, находится в свободном и связанном состоянии. В клетках он находится в связанном состоянии в составе воды и органических со­единений. В атмосфере он присутствует в сво­бодном состоянии в виде молекулярной фор­мы, объемная доля которого составляет 21 %.

По отношению к кислороду, а также по использованию его в процессах получения энергии микроорганизмы подразделяются на 3 группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы.

Облигатные аэробы.
Растут и размножаются только в присутствии кислорода. Используют кислород для получе­ния энергии путем кислородного дыхания.

Энергию получают оксидативным метабо­лизмом, используя кислород как терминаль­ный акцептор электронов в реакции, катали­зируемой цитохромоксидазой.

Облигатные аэробы подразделяются на строгие аэробы, которые растут при парци­альном давлении атмосферы воздуха, и микроаэрофилы, которые, используя кислород в процессах получения энергии, растут при его пониженном парциальном давлении.

Это связано с тем, что у микроаэрофилов имеются ферменты, которые инактивируются при контакте с сильными окислителями и активны только при низких значениях парциального давления кислорода, например, фер­мент гидрогеназа.

Облигатные анаэробы.
Не используют кислород для получения энергии.
Тип метаболизма у них - бродильный, за исключением метаболизма у двух видов бактерий: Desulfovibrio и Desulfotomaculum, которые относятся к хемолитотрофам и обладают сульфатным дыханием. Облигатные анаэробы подразделяются на две группы: строгие анаэробы и аэротолерантные.

Строгие анаэробы характеризуются тем, что молекулярный кислород для них токси­чен: он убивает микроорганизмы или огра­ничивает их рост.

Энергию строгие анаэробы получают маслянокислым брожением. К строгим анаэро­бам относятся, например, некоторые клостридии (С. botulinum, С, tetani), бактероиды.

Аэротолерантные микроорганизмы не ис­пользуют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере.

К этой группе относятся молочнокислые бактерии, получающие энергию гетероферментативным молочнокислым брожением.

Методы культивирования анаэробов.
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов.

Физические методы. Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта - Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль - Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль - Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во­дородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na 2 S2О 4 .
Биологические методы. Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например, часто используют S.aureus или Serratiamarcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

6 ферменты бактерий. Их классификация. Ферментативная активность микробов и ее использование для идентификации бактерий.
В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 клас­сам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образу­емые бактериальной клеткой, могут локали­зоваться как внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь ис­точниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепля­ют крупные молекулы пептидов, полисаха­ридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализо­ваны в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в про­цессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых слу­чаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности поль­зуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзофермен­тов можно определить при помощи диффе­ренциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Идентификация бактерий по фер­ментативной активности.

Наиболее ча­сто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности мик­роорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Че­рез 3-5 дней посевы просматривают и отмечают харак­тер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты - индол, сероводород, аммиак. Для их опреде­ления служат специальные индикаторные бумажки, ко­торые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разло­жения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим при­знаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продук­тов . Для выявления этого используют среды Гисса, со­держащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, маль­тозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2-6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообра­зования в жидкие среды опускают поплавки или исполь­зуют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы оп­ределить интенсивное кислотообразование , характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный -при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению ам­миака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов исполь­зуют реакцию Фогеса - Проскауэра на ацетоин - проме­жуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свиде­тельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешива­ния микробных клеток с 1 % раствором перекиси водоро­да.

Для определения цитохромоксидазы применяют ре­активы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появ­ляющемуся через 2-5 мин.

Для определения нитритов используют реак­тив Грисса: По­явление красного окрашивания свидетельствует о нали­чии нитритов.

7 рост и размножение бактерий. Температурные границы роста. Фазы размножения бактерий на жидких питательных средах.
Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, атакже размноже­нием - самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.
Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается, и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.
Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура - непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов :
1. лаг-фаза;
2. фаза логарифмического роста;
3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий;
4. фаза гибели бактерий.
Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования.

Лаг-фаза - период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.
Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.
Затем наступает фаза стационарного роста , при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.
Завершает процесс роста бактерий фаза гибели , характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность её колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.
Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

8 принципы культивирования бактерий. Методы выделения чистых культур бактерий, цель.
Универсальным инструментом

Посевы «газоном»

Чистой культурой называется популяция бактерий од­ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты - биовары . Биовары, различающие­ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами , по анти­генным свойствам -сероварами , по чувствительности к фагу - фаговарами . Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами , которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим­волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио­логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скоп­ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор­фологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно­стических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче­ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питатель­ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот­ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по мор­фологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на­бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической прак­тике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определя­ют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни­мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент обра­зуют Serratia marcescens, золотистый пигмент - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseu-domonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Методы выделения чистых культур бакте­рий.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки. Первые предварительно из­готовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец ка­пилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец за­крывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Модуль 2. Понятие метаболизма, гомеостаза, физиологической адаптации человека.

Морфо-функциональная характеристика нейрона (сомы, дендритов, аксона, аксонного транспорта, метаболизма). Типы нервных клеток. Функциональная классификация нейронов.

Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что:

• * его интенсивность имеет достаточно высокий уровень, что возможно обусловлено гораздо большим соотношением поверхности к единице массы, чем у многоклеточных;
• * процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;
• * субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк -- от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества -- загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения);
• * бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов -- это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов и широте субстратного спектра.

Ферменты бактерий по локализации делятся на 2 группы:

• * экзоферменты -- ферменты бактерий, выделяемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (протеазы, полисахариды, олигосахаридазы);
• * эндоферменты -- ферменты бактерий, действующие на субстраты внутри клетки (расщепляющие аминокислоты, моносахара, синтетазы).

Синтез ферментов генетически детерминирован, но регуляция их синтеза идет за счет прямой и обратной связи, т. е. для одних -- репрессируется, а для других -- индуцируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде (бета-галактозидаза, бета-лактамаза), называются индуцибельными.

Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными (ферменты гликолиза). Их синтез имеет место всегда, и они всегда содержатся в микробных клетках в определенных концентрациях. Изучают метаболизм бактерий с помощью физико-химических и биохимических методов исследования в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих то или иное соединение в качестве субстрата для трансформации.

Такой подход позволяет судить об обмене веществ путем более, детального изучения процессов различных видов обмена (белков, углеводов) у микроорганизмов.

В большинстве случаев одно и то же вещество используется как в ассимиляции, так и в диссимиляции. Исключением являются углеводы, которые подвергаются расщеплению и не принимают участия в конструктивном обмене.

Метаболизм у микроорганизмов характеризуется интенсивным потреблением питательных веществ. Так, при благоприятных условиях в течение суток одна клетка бактерий усваивает веществ в 30-40 раз больше величины своей массы.

В обмене веществ принимают участие различные химические вещества. В зависимости от этого различают белковый, углеводный, липидный и водносолевой обмен.

Белковый обмен . Распад белка вначале происходит до пептоноз под действием ферментов экзопротеаз. В дальнейшем пептоны под влиянием эндопротеаз расщепляются до аминокислот, которые поступают в клетку. Здесь аминокислоты могут подвергаться дезаминированию и декарбоксилированию.

В результате дезаминирования образуются аммиак, кетокислоты или оксикислоты, спирт и другие вещества.

Декарбоксилирование аминокислот происходит при развитии гнилостных бактерий с образованием токсичных продуктов «трупных ядов». При декарбоксилировании гистидина образуется гистамин, орнитина - путресцин, лизина - кадаверин, тирозина - тирамин. Некоторые микробы вырабатывают фермент триптофаназу, под влиянием которой аминокислота триптофан распадается с образованием индола. Наличие индолообразования используют при идентификации микроорганизмов.

Наряду с реакциями расщепления белков происходят и процессы их синтеза. Для построения белков бактерии используют аминокислоты. Бактериальные клетки удовлетворяют свои потребности в аминокислотах двумя путями: одни микроорганизмы получают аминокислоты при расщеплении белка, другие синтезируют их из простых соединений азота. Важным свойством микробов является способность синтезировать незаменимые аминокислоты (метионин, триптофан, лизин). Синтез белка совершается в рибосомах клетки.

Белковый обмен находится в тесной связи с углеводным обменом. Для построения белковых соединений используется пировиноградная кислота, а дикарбоновые кислоты являются активными посредниками в биосинтезе аминокислот.

Углеводный обмен . Углеводы расщепляются под действием ферментов с образованием глюкозы и мальтозы. Под влиянием ферментов мальтазы, сахаразы, лактазы дисахариды, поступившие внутрь клетки бактерии, подвергаются гидролизу и распаду на моносахариды, которые затем ферментируются с разрывом цепи молекул углевода и освобождением значительного количества энергии.

Расщепление микробами углеводов сопровождается образованием органических кислот, которые могут распадаться до конечных продуктов - ССЬ и Н2О.

Синтез углеводов у микроорганизмов происходит фото- и хе-мосинтетически. При фотосинтезе зеленые и пурпурные бактерии, содержащие пигменты типа хлорофилла, синтезируют глюкозу из диоксида углерода, содержащегося в воздухе. При этом для течения ндотермических реакций синтеза необходима энергия света.

Процесс фотосинтеза у бактерий (прокариот) отличается от фотосинтеза у зеленых растений (эукариоты). У растений при фотолизе донором водорода служит вода, в результате чего выделяется молекулярный кислород.

У прокариот, за исключением синезеленых водорослей, донорами водорода являются H2S, Н2, другие минеральные и органические соединения, поэтому в результате реакции фотосинтеза кислород не образуется. Главным пигментом фотосинтеза у бактерий является бактериохлорофилл, у зеленых растений - хлорофилл, находящийся в хлоропластах, каждый из которых эквивалентен прокариотической клетке. У бактерий хлоропласта отсутствуют.

Хемосинтез осуществляют микроорганизмы, синтезирующие углеводы из глюкозы, которая предварительно образуется в результате сахаролитических реакций, т. е. расщепления сложных Сахаров. Для хемосинтеза используется химическая энергия, освобождаемая при распаде аденозин трифосфорной кислоты (АТФ), т. е. энергия химических реакций.

Липидный обмен включает процессы гидролиза липидов, всасывания жирных кислот и моноглицеридов, биосинтеза специфических липидов, их расщепления и выделения конечных продуктов распада.

Большинство видов бактерий усваивают липиды в виде глицерина, который служит источником энергии. Микроорганизмы используют его также для синтеза липидов, которые в виде включений являются резервными питательными веществами (питательным материалом).

Основные процессы липидного обмена осуществляются при помощи липазы и других липолитических ферментов, прочно связанных с клеточной цитоплазмой.

Водно-солевой обмен включает поступление и выделение воды и минеральных солей, а также превращения, происходящие с ними.

Только небольшое число элементов Периодической системы Д.И. Менделеева требуется микроорганизмам в относительно высоких концентрациях - это десять главных биологических элементов (макроэлементы): С, О, Н, N, S, Р, К, Mg, Са, Fe. Основными компонентами органических соединений являются первые четыре элемента - органогены.

Сера требуется для синтеза аминокислот цистеина и метионина и некоторых ферментов. Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, тейхоевых кислот, многих нуклеотидов. Остальные четыре элемента - это ионы металлов, используемые в качестве кофакторов ферментов, а также компонентов металлокомплексов.

Кроме перечисленных главных элементов микроорганизмам требуются еще десять микроэлементов: Zn, Mn, Na, CI, Mo, Se, Со, Си, W, Ni, которые участвуют в синтезе ферментов, активизируют их.

Из различных элементов и их соединений микроорганизмы синтезируют белки, нуклеопротеиды, глюцидолипиднопротеидные комплексы, нуклеиновые кислоты, ферменты, витамины и др.

Метаболизм (обмен веществ) микроорганизмов

Питание микробов (конструктивный метаболизм).

Как у всего живого, метаболизм микроорганизмов состоит из двух взаимосвязанных, одновременно протекающих, но противоположных процессов - анаболизма, или конструктивного метаболизма, и катабо-лизма, или энергетического метаболизма.

Обмен веществ у микроорганизмов имеет свои особенности.

1) Быстрота и интенсивность обменных процессов. За сутки мик-робная клетка может переработать такое количество питательных ве-ществ, которое превышает ее собственный вес в 30-40 раз.

2) Выраженная приспособляемость к изменяющимся условиям внешней среды.

3) Питание осуществляется через всю поверхность клетки. Прокариоты не проглатывают питательные вещества, не переваривают их внутри клетки, а расщепляют их вне клетки с помощью экзоферментов до более простых соединений, которые транспортируются в клетку.

Для роста и жизнедеятельности микроорганизмов обязательно на-личие в среде обитания питательных материалов для построения ком-понентов клетки и источники энергии. Для микробов необходимы вода, источники углерода, кислорода, азота, водорода, фосфора, калия, на-трия и других элементов. Требуются также микроэлементы: железо, марганец, цинк, медь для синтеза ферментов. Различные виды микро-бов нуждаются в тех или иных факторах роста, таких, как витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания.

В зависимости от способности усваивать органические или не-органические источники углерода и азота микроорганизмы делятся

на две группы - аутотрофов и гетеротрофов.

Аутотрофы (греч. autos - сам, trophic - питающийся) получают уг-лерод из углекислоты (СО 2) или ее солей. Из простых неорганических соединений они синтезируют белки, жиры, углеводы, ферменты.

Транспорт питательных веществ

Через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки прокариотов проникают только небольшие молекулы, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры вначале расщепляются экзоферементами до более простых соединений, которые транспорти-руются внутрь клетки.

Проникновение питательных веществ в клетку происходит с по-мощью различных механизмов.

Пассивная диффузия - вещества поступают в клетку за счет диф-фузии по градиенту концентрации, то есть вследствие того, что кон-центрация вне клетки выше, чем внутри.

Облегченная диффузия - также совершается по градиенту кон-центрации, но с участием ферментов-переносчиков, так называемых пермеаз. Этот фермент присоединяет к себе молекулы вещества на внеш-ней стороне цитоплазматической мембраны и отдает его на внутрен-ней стороне в неизмененном виде. Затем свободный переносчик пере-мещается снова к наружной стороне мембраны, где связывает новые молекулы вещества. При этом каждая пермеаза переносит какое-то определенное вещество.

Эти два механизма переноса не требуют энергетических затрат.

Активный перенос происходит также с участием пермеаз, причем осуществляется против градиента концентрации. Микробная клетка может накопить вещество в концентрации, в тысячи раз превышаю-щих ее во внешней среде. Такой процесс требует затрат энергии, то есть расходуется АТФ.

Транслокация радикалов - это четвертый механизм передачи ве-ществ. Это активный перенос химически измененных молекул, с учас-тием пермеаз. Например, такое простое вещество, как глюкоза, пере-носится в фосфорилированном виде.

Выход веществ из бактериальной клетки происходит путем пас-сивной диффузии или путем облегченной диффузии с участием пермеаз.

Ферменты

Ферменты - катализаторы биологических процессов. Характер-ным свойством ферментов является их специфичность. Каждый фер-мент участвует только в определенной реакции с определенным хи-мическим соединением.

Ферменты, которые выделяются бактериальной клеткой в окру-жающую среду и осуществляют внеклеточное переваривание, называ-ются экзоферментами. К экзоферментам относится также беталактамаза, которая разрушает пенициллин и другие бета-лактамные анти-биотики, защищая бактерии от их действия.

Эндоферменты участвуют в процессах метаболизма внутри клетки.

Для бактерий, в силу их малых размеров, характерна высокая сте-пень саморегуляции продукции ферментов. В этом отношении фермен-ты можно разделить на конститутивные и адаптивные. Конститутив-ные ферменты продуцируются клеткой постоянно. Адаптивные фер-менты, в свою очередь, подразделяются на индуцируемые и ингибируемые. Продукция индуцируемых ферментов происходит в присутствии субстрата. Например, ферменты, расщепляющие лактозу, образуются в клетке в только присутствии этого углевода. Продукция ингибируемых ферментов, напротив, подавляется присутствием в среде конеч-ного субстрата в достаточно большой концентрации (например, трип-тофана).

Многие патогенные бактерии, кроме ферментов обмена, выделя-ют ферменты, являющиеся факторами вирулентности. Например, та-кие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза способствуют проникновению и распространению патогенного микроба в организме.

Способность бактерий продуцировать определенные ферменты -признак настолько постоянный, что его используют для идентифика-ции, то есть определения вида бактерий. Определяют сахаролитические свойства (ферментацию углеводов) и протеолитические свойства (фер-ментацию белков и пептона).

Для микробов характерна высокая ферментативная активность. Это используется в промышленности. В медицине находят применение такие лечебные средства, как стрептокиназа (фибринолизин стреп-тококков), террилитин (протеаза Aspergillus terricola). Ферменты мик-робного происхождения - липазы и протеазы, входящие в состав мою-щих средств и стиральных порошков, расщепляют белковые и жировые загрязнения до воднорастворимых веществ, которые легко смываются водой.

Биологическое окисление (энергетический метаболизм)

Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последователь-ном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.

Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кис-лоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, в частности, глюкоза.

У микроорганизмов существует два типа биологического окис-ления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кисло-род, и этот процесс называется дыханием в строгом смысле слова. При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называет-ся брожением.

Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образова-нием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта

кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.

При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с об-разованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на одну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.

При анаэробном типе биологического окисления энергия образу-ется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превра-щается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокислого брожения является молочная кислота, маслянокислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну моле-кулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.

Микробную природу брожений впервые открыл и доказал Пастер. Изучая маслянокислое брожение, Пастер впервые столкнулся с возможностью жизни без кислорода, то есть с анаэробиозом. Он так-же установил явление, которое впоследствии было названо "эффектом Пастера": прекращение процесса брожения при широком доступе кис-лорода.

Анаэробиоз существует только среди прокариотов. Все микро-организмы по типу дыхания делятся на следующие группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.

Облигатные аэробы размножаются только при наличии свободно-го кислорода. К ним можно отнести микобактерии туберкулеза, хо-лерный вибрион, чудесную палочку. ,

Облигатные или строгие анаэробы получают энергию при от-сутствии доступа кислорода. Они имеют неполный набор окислитель-но-восстановительных ферментов, у них нет цитохромной системы, поэтому у них не происходит полного окисления субстрата (глюкозы) до конечных продуктов - СО 2 и Н 2 О. Более того, в присутствии свобод-ного кислорода образуются токсические соединения: перекись водо-рода Н 2 О 2 и свободный перекисный радикал кислорода О 2 . Аэробы при этом не погибают, так как продуцируют ферменты, разрушающие эти токсические соединения (супероксиддисмутазу и каталазу). Спорообразующие анаэробы в этих условиях прекращают размножение и превращаются в споры. Неспорообразующие анаэробы погибают даже при кратковременном контакте с кислородом.

К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорообразующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии.

Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор фер-ментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до ко-нечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение.

Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших коли-честв кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при 3-6% кислорода.

Рост и размножение микроорганизмов

Термином "рост" обозначают увеличение размеров отдельной осо-би, а "размножение" - увеличение числа особей в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. У грамположительных бактерий из клеточной стен-ки и цитоплазматической мембраны образуется перегородка, враста-ющая внутрь. У грамотрицательных бактерий образуется перетяжка, и затем происходит разделение клетки на две особи.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромо-сомы по полуконсервативному типу. При этом двуспиральная цепь ДНК раскручивается, каждая нить достраивается комплиментарной нитью и в результате каждая дочерняя клетка получает одну мате-ринскую нить и одну вновь образованную.

Быстрота размножения разных видов бактерий различна. Боль-шинство бактерий делятся каждые 15-30 минут. Микобактерии тубер-кулеза делятся медленно - одно деление за 18 часов, спирохеты - одно деление за 10 часов.

Если посеять бактерии в жидкую питательную среду определен-ного объема и затем каждый час брать пробу и определять количество живых бактерий в такой замкнутой среде и составить график, на кото-ром по оси абсцисс откладывать время в часах, а по оси ординат лога-рифм количества живых бактерий, то получим кривую роста бактерий. Рост бактерий подразделяют на несколько фаз (рис. 5):

1) латентная фаза (лаг-фаза) - бактерии адаптируются к пита-тельной среде, количество их не увеличивается;

2) фаза логарифмического ро-ста - количество бактерий увели-чивается в геометрической про-грессии;

3) фаза стационарного роста, во время которой число вновь об-разованных бактерий уравнивает-ся числом погибших, и количество живых бактерий остается постоян-ным, достигая максимального уровня. Это М-концентрация - величина, характерная для каждого вида бактерий;

4) фаза отмирания, когда число отмирающих клеток начинает пре-обладать над числом жизнеспособных бактерий вследствие накопления продуктов метаболизма и истощения среды.

Культура бактерий в такой замкнутой несменяющейся среде на-зывается периодической. Если же в засеянный объем непрерывно подают свежую питательную среду и удаляют такое же количество жидкости, то такую культуру называют непрерывной. Количество живых бактерий в такой культуре будет постоянно в М-концентрации. Непрерывное куль-тивирование применяют в микробиологической промышленности.

Образование микробами пигментов, ароматических веществ. Светящиеся микроорганизмы

Некоторые виды микробов вырабатывают красящие вещества -пигменты. Если пигмент растворим в воде, то окрашенными предс-тавляются и колонии микробов, и питательная среда. Например, си-ний пигмент, выделяемый синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa), окрашивает среду в синий цвет. Пигменты, растворимые в орга-нических растворителях, но нерастворимые в воде, не окрашивают питательную среду. Такой пигмент красного цвета, так называемый продигиозан, растворимый в спирте, выделяет чудесная палочка (Serratia marcescens). К этой же группе относятся пигменты желтого, оранжевого, красного цвета, характерные для кокковой воздушной микрофлоры. У некоторых видов микробов пигменты настолько проч-но связаны с протоплазмой клетки, что не растворяются ни в воде, ни в органических растворителях. Среди патогенных бактерий такие пиг-менты золотистого, палевого, лимонно-желтого цвета образуют ста-филококки.

Цвет пигмента используется для определения вида бактерий.

Некоторые микроорганизмы в процессе метаболизма вырабатыва-ют ароматические вещества. Например, для синегнойной палочки ха-рактерен запах жасмина. Характерный запах сыров, сливочного мас-ла, особый "букет" вина объясняется жизнедеятельностью микробов, которые используются для производства этих продуктов.

Свечение (люминесценция) микробов происходит в результате ос-вобождения энергии при биологическом окислении субстрата. Свечение бывает тем интенсивнее, чем сильнее приток кислорода Светящиеся бактерии были названы фотобактериями. Они придают свечение че-шуе рыб в море, грибам, гниющим деревьям, пищевым продуктам, на поверхности которых размножаются. Свечение может наблюдаться при низких температурах, например, в холодильнике. Патогенных для че-ловека среди фотогенных бактерий не установлено.

Свечение пищевых продуктов, вызванное бактериями, не приво-дит к их порче, и даже может свидетельствовать о том. что в этих про-дуктах не происходит гниения, поскольку оно прекращается при разви-тии гнилостных микроорганизмов.

ГЛАВА 5.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И БИОХИМИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ

Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в ла-боратории, применяется для изучения их свойств и для получения био-массы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые про-стейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в орга-низме животного или в живых клетках.

Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на пита-тельных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микро-организмов.

Питательные среды

Питательные среды должны соответствовать определенным тре-бованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необхо-димые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные мик-роорганизмы растут на простых питательных средах, другие для свое-го размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, ви-таминов.

В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для боль-шинства бактерий благоприятной является питательная среда, со-держащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоп-риятная для большей части патогенных бактерий - слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, гри-бы - при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрач-ными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов.

По составу и происхождению питательные среды бывают естест-венные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт, например, картофель, другие ово-щи. Искусственные питательные среды готовят по определенной про-писи из продуктов с добавлением органических и неорганических со-единений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужид-кие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар -полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С.

Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в кон-центрации 1,5-2%, для полужидкой - 0,5%.

По целевому назначению питательные среды могут быть разде-лены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференци-ально-диагностические.

Обычные (простые) питательные среды применяют для культиви-рования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка.

Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка.

Дифференциально-диагностические питательные среды применя-ются для отличия одних видов бактерий от других по их фермента-тивной активности (см. соответствующий раздел).

Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Боль-шинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, ес-тественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроор-ганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэ-робность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохими-ческие и другие свойства микробов, необходимо получить чистую куль-туру. Обычно культурой микробов называют скопление их на пи-тательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) рос-та или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чи-стая культура - это культура микробов одного вида, полученная из од-ной колонии. В лабораториях для различных исследований применя-ют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в опре-деленное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения актив-ности пенициллина.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, ок-рашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего пита-тельного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют остав-шуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на тре-тьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наи-меньшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изоли-рованные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од-ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер-вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре-тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су-точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непроз-рачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отби-рают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным пита-тельным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бак-терий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных пита-тельных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные коло-нии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кру-жевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми края-ми, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Документ

В качестве первого частой Глава ... сельскохозяйственной микробиологии (С.–Петербург) и чешскими микробиологами Общая

Глава 4 прорывные технологии в системах жизнеобеспечения содержание главы 4 1 жизнеобеспечение человека

Литература

В качестве первого примера рассмотрим систему... частой причиной желудочных расстройств. Глава ... сельскохозяйственной микробиологии (С.–Петербург) и чешскими микробиологами . ... М: Энергоатомиздат, 1992 Ацюковский В.А. Общая эфиродинамика. - М: Энергоатомиздат, ...

Наши книги отличают тщательность редакционной подготовки высокое качество полиграфического исполнения и доступность читателю

Учебники

Вузов. Учебник состоит из семи частей . Часть первая - «Общая микробиология» - содержит сведения о морфологии и физиологии бактерий... здравоохранения Российской Федерации в 1997 году. В первой главе содержится пропедевтический курс и диететика; во...

Для понимания сложных процессов обмена веществ микроорганизмов необходимо рассмотреть химический состав микробной клетки и арсенал ферментов, которыми она располагает.

Химический состав микробных клеток.

Химический состав микробных клеток тот же, что и у высших растений. В них содержится 75-85 % воды и 15-25 % сухого вещества от общей массы клетки.

Вода является необходимой составной частью клетки - в ней происходят химические процессы, растворяются минеральные и расщепляются сложные органические вещества - белки, углеводы, жиры. Белки и нуклеиновые кислоты имеют наиболее важное значение при размножении и росте клеток. Углеводы в значительных количествах содержатся в клетках дрожжей и грибов. Это полисахариды - гликоген, декстрин, глюкоза. В клетках бактерий углеводов мало.

Жиры и жироподобные вещества (липиды) находятся главным образом в поверхностном слое цитоплазмы. На липиды приходится в среднем 3-7 % сухого вещества клетки (у туберкулезной палочки - 20-40, грибов Эндомицес - 50-60%).

Минеральные вещества содержатся в клетках микроорганизмов в небольших количествах (всего 3-10%), но роль их велика - они влияют на скорость и направление химических реакций. Наиболее важные из них - калий, магний, кальций, железо и др. Содержание в клетках белков, жиров, углеводов и минеральных веществ зависит от вида микроорганизма и условий его существования.

Ферменты микробной клетки.

Ферменты - это сложные органические вещества, катализирующие химические реакции. Клетки вырабатывают (продуцируют) их для осуществления физиологических процессов. В клетке может содержаться много ферментов (у гриба Аспергиллус, например, - около 50), благодаря чему одновременно могут происходить различные химические реакции. Наиболее распространенными ферментами, продуцируемыми микроорганизмами, являются карбогидразы и протеазы.

Карбогидразы - расщепляют крахмал, клетчатку и другие полисахариды при участии воды. Сюда относятся амилазы (расщепляют крахмал до простых углеводов), мальтаза (расщепляет углевод мальтозу), липаза (гидролизует жиры и масла с образованием жирных кислот). Эти ферменты содержит большинство микроорганизмов.

Протеазы катализируют расщепление белков и полипептидов. Эти ферменты продуцируются гнилостными бактериями, плесневыми грибами, актиномицетами.

Каждый фермент обладает специфичностью действия, т. е. может расщеплять лишь определенные соединения. Кроме того, для действия каждого фермента имеются свои кардинальные точки в отношении температуры, рН и других условий.

Метаболизм.

Каждая живая клетка нуждается в постоянном притоке энергии - эту энергию она получает в процессе обмена веществ. Обменом веществ (метаболизмом) называют совокупность всех химических реакций, протекающих в клетке в процессе ее жизнедеятельности.

Метаболизм осуществляется в двух основных направлениях.

Одно из них - строительный обмен. Он необходим живой клетке для биосинтетической деятельности, т. е. для построения клетки, замены изношенных частей, роста и размножения. Необходимый строительный материал клетка получает в виде пищи, поступающей извне. Питательные вещества проникают в микробную клетку двумя путями. Первый - это осмос (диффузия) питательных веществ, из внешней среды, где концентрация их выше, чем в клетке. Движущей силой при этом является разность осмотических давлений между клеткой и внешней средой. Второй путь - это активный перенос питательных веществ в клетку с помощью особых ферментов. В обоих случаях питательные вещества проникают через клеточную мембрану в цитоплазму клетки. Процесс питания является важнейшей физиологической функцией микробной клетки. Сущность процесса питания состоит в том, что под действием ферментов клетки высокомолекулярные органические соединения расщепляются до низкомолекулярных: Сахаров, аминокислот, органических кислот, а из них синтезируются вещества самой клетки микроорганизма: цитоплазма, клеточная стенка, нуклеиновые кислоты и др.

Кроме питательных веществ для строительной биосинтетической деятельности клетка нуждается в энергии. Поэтому второй стороной обмена веществ микроорганизмов является энергетический обмен, т. е. обеспечение клетки энергией. Энергию микроорганизмы получают окислением органических веществ (углеводов, жиров и других энергетических материалов) в процессе дыхания - очень важной физиологической функции. У разных организмов процесс дыхания протекает по-разному в зависимости от их отношения к кислороду. Так, аэробы используют газообразный кислород и получают энергию путем окисления органических веществ (дыхания). Это возможно благодаря наличию в клетках аэробов определенных ферментов - цитохромов. У анаэробов эти ферменты отсутствуют и процесс получения энергии протекает без участия кислорода. По отношению к кислороду анаэробы делятся на три группы. Строгие анаэробы (например, маслянокислые бактерии) вообще не могут жить в присутствии кислорода. Они получают энергию сопряженным окислением - восстановлением субстрата (например, процессы брожения). Факультативные анаэробы (не строгие) в присутствии кислорода используют его для окислительных процессов (для дыхания), а в его отсутствие получают энергию без участия кислорода (дрожжи).

Окислительные процессы анаэробов заключаются в отнятии водорода от окисляемого соединения (дегидрирование). Водород присоединяется к другим веществам (акцепторам водорода). Такой процесс бескислородного дыхания называют брожением. Энергетическим материалом для брожения служат вещества с большим запасом энергии.

Таким образом, питательные вещества расходуются клеткой в двух направлениях: для синтеза веществ тела и для обеспечения организма энергией. Процессы питания и дыхания тесно связаны и осуществляются клеткой одновременно. Они обеспечивают все жизненные функции клетки. Образующиеся при этом продукты обмена выделяются из клетки во внешнюю среду. Обмен веществ показан на схеме 1 ниже.

Схема 1. Обмен веществ у микроорганизмов.

По типу питания микробы делят на две группы: автотрофы и гетеротрофы.

Автотрофы - микроорганизмы, которые синтезируют вещества своего тела из неорганических элементов. Пути для этого синтеза могут быть разными. Одни микроорганизмы, например пурпурные серобактерии, подобно зеленым растениям, используют фотосинтез, но роль хлорофилла выполняют у них другие вещества. Другие энергию для этих синтетических процессов получают в ходе окислительно-восстановительных реакций. При этом донорами электронов служат неорганические вещества, а источником углерода - углекислый газ.

Гетеротрофы - это микроорганизмы, которые нуждаются в готовых органических соединениях, используя в качестве источников углерода углеводы, спирты и органические кислоты, а источников азота - белки и продукты их распада. Подавляющее большинство бактерий, дрожжей и плесневых грибов является гетеротрофами.

Микробиология: конспект лекций Ткаченко Ксения Викторовна

3. Метаболизм бактериальной клетки

Особенности метаболизма у бактерий:

1) многообразие используемых субстратов;

2) интенсивность процессов метаболизма;

4) преобладание процессов распада над процессами синтеза;

5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма.

В процессе метаболизма выделяют два вида обмена:

1) пластический (конструктивный):

а) анаболизм (с затратами энергии);

б) катаболизм (с выделением энергии);

2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах):

а) дыхание;

б) брожение.

В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Для аэробов акцептором является кислород. Факультативные анаэробы в кислородных условиях используют процесс дыхания, в бескислородных – брожение. Для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки.

В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами. По строению выделяют:

1) простые ферменты (белки);

2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов.

Различают также:

1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата);

2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата).

Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.

По месту действия выделяют:

1) экзоферменты (действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий);

2) эндоферменты (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ).

В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов:

1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами);

2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп);

3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей);

4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции);

5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров);

6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ).

Из книги Микробиология: конспект лекций автора Ткаченко Ксения Викторовна

1. Особенности строения бактериальной клетки. Основные органеллы и их функции Отличия бактерий от других клеток1. Бактерии относятся к прокариотам, т. е. не имеют обособленного ядра.2. В клеточной стенке бактерий содержится особый пептидогликан – муреин.3. В

Из книги Краткая история биологии [От алхимии до генетики] автора Азимов Айзек

Глава 12 Метаболизм ХимиотерапияБорьба с бактериальными заболеваниями во многом проще, чем с вирусными. Как уже было показано, бактерии проще размножаются в культуре. Бактерии более уязвимы. Живя вне клетки, они производят ущерб организму, отнимая у него питание либо

Из книги Тесты по биологии. 6 класс автора Бенуж Елена

КЛЕТОЧНОЕ СТРОЕНИЕ ОРГАНИЗМОВ СТРОЕНИЕ КЛЕТКИ. ПРИБОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРОЕНИЯ КЛЕТКИ 1. Выберите один наиболее правильный ответ.Клетка – это:A. Мельчайшая частица всего живогоБ. Мельчайшая частица живого растенияB. Часть растенияГ. Искусственно созданная единица для

Из книги Биология [Полный справочник для подготовки к ЕГЭ] автора Лернер Георгий Исаакович

Из книги Бегство от одиночества автора Панов Евгений Николаевич

Клетки-коллективисты и клетки-одиночки В основе тесной кооперации клеток, входящих в состав многоклеточного организма, лежат по меньшей мере две важнейшие причины. Во-первых, каждая отдельно взятая клетка, будучи сама по себе на редкость умелым и исполнительным

Из книги Путешествие в страну микробов автора Бетина Владимир

Анатомия бактериальной клетки В предыдущей главе мы познакомились с тремя главнейшими типами бактериальных клеток. Одни из них имеют форму шариков, другие - палочек или цилиндриков, а третьи представляют подобие спирали.Какова же внешняя и внутренняя структура

Из книги Распространненость жизни и уникальность разума? автора Мосевицкий Марк Исаакович

5.3.1 Концепция формирования митохондрий и хлоропластов путем симбиоза бактериальной клетки и раннего эукариота Около 2 млрд лет тому назад на Земле создалась критическая для дальнейшего развития жизни ситуация. Фотосинтезирующие бактерии, размножившись, стали

Из книги Размножение организмов автора Петросова Рената Арменаковна

3. Деление клетки Способность к делению - это важнейшее свойство клетки. В результате деления из одной клетки возникают две новые. Одно из основных свойств жизни - самовоспроизведение - проявляется уже на клеточном уровне. Наиболее распространенным способом деления

Из книги Биологическая химия автора Лелевич Владимир Валерьянович

Глава 8. Введение в метаболизм Обмен веществ или метаболизм – это совокупность химических реакций в организме, которые обеспечивают его веществами и энергией, необходимыми для жизнедеятельности. Процесс метаболизма, сопровождающийся образованием более простых

Из книги автора

Метаболизм фруктозы Значительное количество фруктозы, образующее при расщеплении сахарозы, прежде чем поступить в систему воротной вены, превращается в глюкозу уже в клетках кишечника. Другая часть фруктозы всасывается с помощью белка-переносчика, т.е. путем

Из книги автора

Метаболизм галактозы Галактоза образуется в кишечнике в результате гидролиза лактозы.Нарушение метаболизма галактозы проявляется при наследственном заболевании – галактоземии. Оно является следствием врожденного дефекта фермента

Из книги автора

Метаболизм лактозы Лактоза, дисахарид содержится только в молоке и состоит из галактозы и глюкозы. Лактоза синтезируется только секреторными клетками желез млекопитающих в период лактации. Она присутствует в молоке в количестве от 2 % до 6 % в зависимости от вида

Из книги автора

Глава 22. Метаболизм холестерола. Биохимия атеросклероза Холестерол – стероид, характерный только для животных организмов. Основное место его образования в организме человека – печень, где синтезируется 50% холестерола, в тонком кишечнике его образуется 15–20%, остальное

Из книги автора

Глава 25. Метаболизм отдельных аминокислот Метаболизм метионина Метионин – незаменимая аминокислота. Метильная группа метионина – мобильный одноуглеродный фрагмент, используемый для синтеза ряда соединений. Перенос метильной группы метионина на соответствующий

Из книги автора

Метаболизм метионина Метионин – незаменимая аминокислота. Метильная группа метионина – мобильный одноуглеродный фрагмент, используемый для синтеза ряда соединений. Перенос метильной группы метионина на соответствующий акцептор называют трансметилированием,

Из книги автора

Метаболизм фенилаланина и тирозина Фенилаланин – незаменимая аминокислота, так как в клетках животных не синтезируется ее бензольное кольцо. Метаболизм метионина осуществляется по 2-м путям: включается в белки или превращается в тирозин под действием специфической