Организма.
Индуцированными мутациями называют наследуемые изменения генома , возникающие в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды .
Мутации появляются постоянно в ходе процессов, происходящих в живой клетке. Основные процессы, приводящие к возникновению мутаций - репликация ДНК , нарушения репарации ДНК , транскрипции и генетическая рекомбинация .
Связь мутаций с репликацией ДНК [ | ]
Многие спонтанные химические изменения нуклеотидов приводят к мутациям, которые возникают при репликации . Например, из-за дезаминирования цитозина напротив гуанина в цепь ДНК может включаться урацил (образуется пара У-Г вместо канонической пары Ц-Г). При репликации ДНК, напротив урацила в новую цепь включается аденин , образуется пара У-А, а при следующей репликации она заменяется на пару Т-А, то есть происходит транзиция (точечная замена пиримидина на другой пиримидин или пурина на другой пурин).
Связь мутаций с рекомбинацией ДНК [ | ]
Из процессов, связанных с рекомбинацией, наиболее часто приводит к мутациям неравный кроссинговер . Он происходит обычно в тех случаях, когда в хромосоме имеется несколько дуплицированных копий исходного гена, сохранивших похожую последовательность нуклеотидов. В результате неравного кроссинговера в одной из рекомбинантных хромосом происходит дупликация , а в другой - делеция .
Связь мутаций с репарацией ДНК [ | ]
Таутомерная модель мутагенеза [ | ]
Предполагается, что одной из причин образования мутаций замены основания является дезаминирование 5-метилцитозина , что может вызывать транзиции от цитозина к тимину. Из-за дезаминирования цитозина напротив него в цепь ДНК может включаться урацил (образуется пара У-Г вместо канонической пары Ц-Г). При репликации ДНК напротив урацила в новую цепь включается аденин, образуется пара У-А, а при следующей репликации она заменяется на пару Т-А, то есть происходит транзиция (точечная замена пиримидина на другой пиримидин или пурина на другой пурин).
Классификации мутаций [ | ]
Существует несколько классификаций мутаций по различным критериям. Мёллер предложил делить мутации по характеру изменения функционирования гена на гипоморфные (измененные аллели действуют в том же направлении, что и аллели дикого типа; синтезируется лишь меньше белкового продукта), аморфные (мутация выглядит, как полная потеря функции гена, например, мутация white у Drosophila), антиморфные (мутантный признак изменяется, например, окраска зерна кукурузы меняется с пурпурной на бурую) и неоморфные .
В современной учебной литературе используется и более формальная классификация, основанная на характере изменения структуры отдельных генов, хромосом и генома в целом. В рамках этой классификации различают следующие виды мутаций:
- геномные ;
- хромосомные ;
- генные .
Точечная мутация, или единственная замена оснований, - тип мутации в ДНК или РНК, для которой характерна замена одного азотистого основания другим. Термин также применяется и в отношении парных замен нуклеотидов. Термин точечная мутация включает так же инсерции и делеции одного или нескольких нуклеотидов. Выделяют несколько типов точечных мутаций.
Встречаются также сложные мутации. Это такие изменения ДНК, когда один её участок заменяется участком другой длины и другого нуклеотидного состава .
Точечные мутации могут появляться напротив таких повреждений молекулы ДНК, которые способны останавливать синтез ДНК. Например, напротив циклобутановых пиримидиновых димеров. Такие мутации называются мишенными мутациями (от слова «мишень») . Циклобутановые пиримидиновые димеры вызывают как мишенные мутации замены оснований , так и мишенные мутации сдвига рамки .
Иногда точечные мутации образуются на, так называемых, неповрежденных участках ДНК, часто в небольшой окрестности от фотодимеров. Такие мутации называются немишенными мутациями замены оснований или немишенными мутациями сдвига рамки .
Точечные мутации образуются не всегда сразу же после воздействия мутагена. Иногда они появляются после десятков циклов репликаций. Это явление носит название задерживающихся мутаций . При нестабильности генома, главной причине образования злокачественных опухолей, резко возрастает количество немишенных и задерживающихся мутаций .
Возможны четыре генетических последствия точковых мутаций: 1) сохранение смысла она из-за вырожденности генетического а (синонимическая замена нуклеотида), 2) изменение смысла она, приводящее к замене аминокислоты в соответствующем месте полипептидной цепи (миссенс-мутация), 3) образование бессмысленного она с преждевременной терминацией (нонсенс-мутация). В генетическом е имеются три бессмысленных она: амбер - UAG, охр - UAA и опал - UGA (в соответствии с этим получают название и мутации, приводящие к образованию бессмысленных триплетов - например амбер-мутация), 4) обратная замена (стоп-она на смысловой он).
По влиянию на экспрессию генов мутации разделяют на две категории: мутации типа замен пар оснований и типа сдвига рамки считывания (frameshift) . Последние представляют собой делеции или вставки нуклеотидов, число которых не кратно трём, что связано с триплетностью генетического а.
Первичную мутацию иногда называют прямой мутацией , а мутацию, восстанавливающую исходную структуру гена, - обратной мутацией , или реверсией. Возврат к исходному фенотипу у мутантного организма вследствие восстановления функции мутантного гена нередко происходит не за счет истинной реверсии, а вследствие мутации в другой части того же самого гена или даже другого неаллельного гена. В этом случае возвратную мутацию называют супрессорной. Генетические механизмы, благодаря которым происходит супрессия мутантного фенотипа, весьма разнообразны.
Почковые мутации (спорты) - стойкие соматические мутации, происходящие в клетках точек роста растений. Приводят к клоновой изменчивости . При вегетативном размножении сохраняются. Многие сорта культурных растений являются почковыми мутантами .
Последствия мутаций для клетки и организма [ | ]
Мутации, которые ухудшают деятельность клетки в многоклеточном организме, часто приводят к уничтожению клетки (в частности, к программируемой смерти клетки, - апоптозу). Если внутри- и внеклеточные защитные механизмы не распознали мутацию, и клетка прошла деление, то мутантный ген передастся всем потомкам клетки и, чаще всего, приводит к тому, что все эти клетки начинают функционировать иначе.
Кроме того, закономерно различается частота мутирования разных генов и разных участков внутри одного гена. Также известно, что высшие организмы используют «целенаправленные» (то есть происходящие в определённых участках ДНК) мутации в механизмах иммунитета [ ] . С их помощью создаётся разнообразие клонов лимфоцитов , среди которых в результате всегда находятся клетки, способные дать иммунный ответ на новую, неизвестную для организма болезнь. Подходящие лимфоциты подвергаются положительной
Мутации являются важным объектом исследования цитогенетиков и биохимиков. Именно мутации, генные или хромосомные, чаще всего являются причиной наследственных заболеваний. В естественных условиях хромосомные перестройки происходят очень редко. Мутации, вызванные химическими реактивами, биологическими мутагенами или физическими факторами, такими как ионизирующее излучение, часто являются причиной врожденных патологий развития и злокачественных новообразований.
Общие сведения о мутациях
Мутацию Гуго де Фриз определил как внезапное изменение наследственного признака. Это явление встречаются в геноме всех живых организмов, от бактерий до человека. При нормальных условиях мутации в нуклеиновых кислотах происходят очень редко, с частотой примерно 1·10 -4 - 1·10 -10 .
В зависимости от количества затронутого изменениями генетического материала, мутации делят на геномные, хромосомные и генные. Геномные связанны с изменением количества хромосом (моносомия, трисомия, тетрасомия); хромосомные связаны с изменением структуры отдельных хромосом (делеции, дубликации, транслокации); генные мутации затрагивают отдельный ген. Если мутация затронула только одну пару нуклеотидов, то она - точечная.
В зависимости от причин, вызвавших их, выделяют спонтанные и индуцированные мутации.
Спонтанные мутации
Возникают в организме под воздействием внутренних факторов. Спонтанные мутации считаются нормальным явлением, они редко приводят к серьезным последствиям для организма. Чаще всего такие перестройки происходят в пределах одного гена, связаны с заменой оснований - пурина на другой пурин (транзиции), или пурина на пиримидин (трансверсии).
Значительно реже спонтанные мутации происходят в хромосомах. Обычно хромосомные спонтанные мутации представлены транслокациями (переходом одного или нескольких генов одной хромосомы на другую) и инверсиями (изменением последовательности генов в хромосоме).
Индуцированные перестройки
Индуцированные мутации возникают в клетках организма под воздействием химикатов, радиации или репликационного материала вирусов. Такие мутации проявляются чаще, чем спонтанные, имеют более серьезные последствия. Они влияют на отдельные гены и группы генов, блокируя синтез отдельных белков. Индуцированные мутации часто глобально влияют на геном, именно под воздействием мутагенов в клетке появляются аномальные хромосомы: изохромосомы, кольцевые хромосомы, дицентрики.
Мутагены, помимо хромосомных перестроек, вызывают повреждения ДНК: двунитевые разрывы, образование ДНК-сшивок.
Примеры химических мутагенов
К химическим мутагенам относятся нитраты, нитриты, аналоги азотистых оснований, азотистая кислота, пестициды, гидроксиламин, некоторые пищевые добавки.
Азотистая кислота вызывает отщепление аминогруппы от азотистых оснований и замену их другой группой. Это приводит к точковым мутациям. Химически индуцированные мутации также вызывает гидроксиламин.
Нитраты и нитриты в больших дозах повышают риск возникновения рака. Некоторые пищевые добавки вызывают реакции арилирования нуклеиновых кислот, что приводит к нарушению процессов транскрипции и трансляции.
Химические мутагены очень разнообразны. Часто именно эти вещества вызывают индуцированные мутации в хромосомах.
К физическим мутагенам относятся ионизирующее излучение, прежде всего коротковолновое, и ультрафиолет. Ультрафиолет запускает процесс в мембранах, провоцирует образование различных дефектов в ДНК.
Рентгеновское и гамма-излучение провоцируют мутации на уровне хромосом. Такие клетки не способны к делению, они погибают в ходе апоптоза. Индуцированные мутации могут затрагивать и отдельные гены. Например, блокирование генов опухолевых супрессоров приводит к появлению опухолей.
Примеры индуцированных перестроек
Примерами индуцированных мутаций могут служить различные генетические заболевания, чаще проявляющиеся в зонах, подверженных воздействию физического или химического мутагенного фактора. Известно, в частности, что в индийском штате Керала, где годовая эффективная доза ионизирующего излучения превосходит норму в 10 раз, повышена частота рождения детей с синдромом Дауна (трисомия по 21-й хромосоме). В китайском округе Янцзян в почве выявлено большое количество радиоактивного монацита. Нестабильные элементы в его составе (церий, торий, уран) распадаются с выделением гамма-квантов. Воздействие коротковолнового излучения на жителей округа привело к большому количеству рождений детей с синдромом кошачьего крика (делеция большого участка 8-й хромосомы), а также повышенной заболеваемости раком. Еще один пример: в январе 1987 года на Украине было зарегистрировано рекордное количество рождений детей с синдромом Дауна, связанное с аварией на ЧАЭС. На первом триместре беременности плод наиболее чувствителен к воздействию физических и химических мутагенов, потому колоссальная доза радиации привела к повышению частоты аномалий хромосомного набора.
Один из самых печально известных химических мутагенов в истории - седативное средство "Талидомид", выпускаемое в ФРГ в 50-х годах прошлого века. Прием этого препарата привел к рождению множества детей с самыми разными генетическими отклонениями.
Метод индуцированных мутаций обычно применяется учеными для поиска оптимальных способов борьбы с аутоиммунными заболеваниями и генетическими отклонениями, связанными с гиперсекрецией белков.
Мутационный процесс характеризуется частотой возникновения мутаций и направлением мутирования генов.
Частота возникновения мутаций является одной из определяющих черт каждого вида животных, растений и микроорганизмов: одни виды обладают более высокой мутационной изменчивостью, чем другие. Эти различия обусловлены влиянием многих факторов общего и частного значения: генотипического строения вида, степени его адаптации к условиям внешней среды, места его распространения, силы действия природных факторов и т. д. Как бы организм ни был защищен от воздействия внешней среды, протекающие в нем химические процессы, связанные с обменом веществ, могут быть причиной спонтанной мутационной изменчивости. Под этим термином мы скрываем свое незнание конкретных причин мутаций.
В настоящее время еще нет полного представления о частоте возникновения мутаций за одно поколение. Это объясняется тем, что мутации чрезвычайно разнообразны как по фенотипическому проявлению, так и по генетической обусловленности, а методы их учета несовершенны; лишь в отношении мутабильности отдельных локусов можно дать более или менее точную оценку. Как правило, одновременно мутирует лишь один из членов аллельной пары, что объясняется редкостью самого мутирования; одновременное мутирование обоих членов - маловероятное событие.
Установленные общие закономерности частоты спонтанного мутирования сводятся к следующим положениям:
- различные гены в одном генотипе мутируют с разной частотой;
- сходные гены в разных генотипах мутируют с различной скоростью.
Эти два положения иллюстрируются таблицами.
В первой из них показана частота мутирования разных генов на примере кукурузы, во второй - сравнивается мутирование генов у разных видов животных, растений и человека, а у кукурузы - мутирование одних и тех же генов в разных линиях, имеющих разные генотипы.
Итак, различные гены мутируют с разной частотой, т. е. имеются гены мутабильные и стабильные. Каждый ген мутирует относительно редко, но так как число генов в генотипе может быть огромным, то суммарная частота мутирования различных генов оказывается довольно высокой. Для дрозофилы этот расчет показывает одну мутацию примерно на 100 гамет за одно поколение. Однако подобные расчеты пока не очень точны, так как фактически нельзя отличить единичное изменение локуса от сложных мелких реорганизаций в хромосомах; кроме того, очень трудно установить одновременное мутирование в разных хромосомах в пределах одной клетки.
Исходя из редкости самого события - мутации гена, следует объяснять и тот факт, что обычно наблюдают мутирование лишь в одном из локусов. Генетика не знает ни одного достоверного факта одновременного мутирования двух аллелей в гомологичных хромосомах. Но возможно, что это объясняется самим механизмом возникновения мутаций.
Причины спонтанного мутирования генов остаются еще далеко не выясненными. Одной из главных причин, обусловливающих разную частоту мутирования, является сам генотип. Один и тот же ген R r в двух линиях кукурузы мутирует к r r по-разному: в одной - с частотой 6,2, а в другой - 18,2 на 10 000 гамет. Установлено также, что частота возникновения летальных мутаций у разных линий дрозофилы различна.
С помощью селекции можно создать линии, которые будут иметь разную спонтанную мутабильность. В пользу этого говорит тот факт, что существуют специальные гены - мутаторы, которые влияют на скорость мутирования других генов. Так, например, У кукурузы вблизи левого конца короткого плеча IX хромосомы лежит локус Dt, который влияет на мутабильность локуса А, находящегося в длинном плече III хромосомы. Правда, до сих пор не совсем ясно, что представляет собой локус Dt. Возможно, он является какой-либо хромосомной перестройкой.
Влияние генотипа на спонтанную мутабильность отдельного гена проявляется также при гибридизации. Имеются указания на то, что частота мутирования одного и того же локуса выше у гибридных организмов, чем у исходных форм.
Спонтанный мутационный процесс обусловлен также физиологическим состоянием и биохимическими изменениями в клетках.
Так, например, М. С. Навашин и Г. Штуббе показали, что в процессе старения семян при хранении в течение нескольких лет частота мутаций, особенно типа хромосомных перестроек, значительно увеличивается. Подобное явление наблюдается в отношении частоты летальных мутаций у дрозофилы при хранении спермы в семеприемниках самок. Такого рода факты указывают на то, что спонтанное мутирование гена зависит от физиологических и биохимических изменений клетки, связанных с внешними условиями.
Одной из возможных причин спонтанного мутирования может быть накопление в генотипе мутаций, блокирующих биосинтез тех или иных веществ, вследствие чего будет происходить чрезмерное накопление предшественников таких веществ, которые могут влиять на изменение генов. Эта гипотеза поддается экспериментальной проверке.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
Мутации, индуцированные радиацией
Именно при исследовании радиационного мутагенеза была впервые показана возможность индуцировать мутации при действии факторов внешней среды.
Основы радиационной генетики были заложены работами Г.А.Надсона и Г.Т.Филиппова в 1925г. в опытах на плесневых и дрожжевых грибах.
Позже, в 1927г. Г.Д.Меллер, используя методы количественного учета мутаций у дрозофилы, обосновал факт мутагенного действия рентгеновских лучей.
В 1928г. Л.Д.Стадлер в опытах на ячмене и кукурузе показал, что ионизирующие излучения разных видов способны вызывать мутации.
В последующие два десятилетия происходило достаточно активное развитие классической радиационной генегики. Основные положения ее изложены в трудах Д.Ли, Д.Кэтчсайда, Н.В.Тимофеева-Ресовского, К.Г.Циммера, А.Хол-ландера, А.С.Серебровского, Н.П.Дубинина, Ядерные взрывы, прогремевшие в Хиросиме и Нагасаки, стимулировали бурное развитие работ по изучению влияния радиации на человека. Усилия ученых многих стран привели к разработке современных представлений о механизмах воздействия ионизирующих излучений. При этом основные закономерности воздействия ионизирующих излучении были вскрыты в исследованиях, проведенных на микроорганизмах, растениях и животных. Используя принципы экстраполяции, результаты, полученные на экспериментальных объектах, широко используют для оценки генетического риска облучения человека. Например, исследования, проведенные на мышах, в ходе которых изучали частоту индуцированных радиацией катаракт и скелетных аномалий, явились основой для расчета ожидаемой частоты индуцированных доминантных мутаций у человека.
Все радиобиологические эффекты, вызываемые ионизирующими излучениями у различных видов живых существ, могут быть подразделены на стохастические и нестохастические.
Стохастические эффекты характеризуются линейной беспороговой зависимостью вероятности их появления от дозы ионизирующего излучения. При этом от величины дозы зависит частота рассматриваемых событий, а не их тяжесть. К таким эффектам относятся генетические последствия облучения и радиационный канцерогенез.
Нестохастические эффекты имеют пороговую (сигмоидную) зависимость от дозы, причем с дозой связана как вероятность эффекта, так и его тяжесть. Примерами нестохастических эффектов являются: лучевая болезнь, сокращение продолжительности жизни, смертность, индуцированные радиацией пороки развития, поражение иммунной системы. Следует заметить, что механизмы возникновения стохастических и нестохастических эффектов совершенно различны, поэтому при оценке рисков появления этих эффектов в результате облучения недопустимо их объединение.
Сходство и различие спонтанных и индуцированных мутаций
В повреждающем действии радиации на генетический аппарат клетки есть несколько основных моментов, которые имеют важное значение для оценки последствий облучения.
Как показали многочисленные исследования, ионизирующие излучения вызывают все типы мутаций, свойственные спонтанному, мутационному процессу - точковые мутации, аберрации хромосом и генные мутации. Однако следует отметить, что не все типы спонтанных мутаций с одинаковой частотой увеличиваются под действием радиации.
Одним из фундаментальных предложений, на которых основаны оценки риска облучения человека, является допущение сходства спонтанных и индуцированных ионизирующими излучениями мутаций. Предполагая такое сходство, можно оценить вред, причиненный воздействием радиации, путем расчета, какую прибавку к спонтанному мутационному процессу дает мутагенез, вызванный облучением. Так производится определение дозы, удваивающей естественный мутационный процесс. Однако экспериментальные данные молекулярной генетики демонстрируют различия между спонтанными и индуцированными мутациями, вызывающими менделевские болезни. Остановимся на этом важном вопросе и рассмотрим различия между этими мутациями:
спонтанные мутации - это чаще всего точковые мутации и небольшие делеции;
индуцированные мутации - делеции, затрагивающие многие гены.
Спонтанные мутации могут вызывать как утрату, так и усиление функции генов, большинство же индуцированных мутаций вызывает потерю функции. Происхождение спонтанных мутаций связано с организацией генов, т.е. они сайт-специфичны.
Ииндуцированные мутации происходят в результате случайного попадания энергии излучения в генетический материал и могут затрагивать несколько генов, имеющих разное значение для выживаемости организма.
Из этих различий между спонтанными и индуцированными мутациями следует важное следствие: вероятность того, что радиация приведет к возникновению мутаций, обладающих такой же специфичностью, какой обладают спонтанные мутации, очень мала. Другими словами, спектры спонтанных и индуцированных радиацией мутаций, как следует из молекулярно-генетических исследований, существенно различаются.
Ионизирующие излучения в основном индуцируют микроделеции, поэтому важно проанализировать, какими проявлениями на уровне фенотипа человека сопровождаются такие микроделеционные изменения. Поскольку данные о микроделеционных синдромах, связанных с воздействием ионизирующих излучений на человека, отсутствуют, рассмотрим, к каким последствиям для здоровья человека приводят спонтанные синдромы, связанные с микроделециями. Таких синдромов в настоящее время известно около 30. Все они связаны с микроделециями в разных хромосомах и обычно сопровождаются потерей функции нескольких генов. Фенотипы носителей таких микроделеции зависят от участков хромосом, затронутых микроделециями (например, хромосомы 19 и 22 изобилуют генами, а хромосомы 4 и 13 генами обеднены), но тем не менее разные делеции имеют ряд общих признаков - они вызывают многочисленные нарушения развития, умственную отсталость, замедленный рост, дисморфные черты лица. Очевидно, такие же изменения в фенотипе человека будут вызывать микроделеции, возникающие в результате радиационного воздействия. Основной особенностью таких микроделеционных фенотипов является несходное с фенотипами большинства спонтанных мутаций, нечеткое, неясное их проявление.
Различия в клинических фенотипах спонтанных и индуцированных ионизирующими излучениями мутаций имеют принципиальное значение для оценки риска облучения человека. Дело в том, что при изучении последствий воздействия ионизирующих излучений на популяции человека обычно проводят анализ социально значимых отклонений от нормы, которое традиционно связывают с отклонениями, подобными фенотипическим проявлениям спонтанных мутаций. Изменения же, связанные с микроделеционными синдромами, практически остаются вне поля зрения исследователей в силу их нечеткого проявления. Таким образом, большая часть фенотипических отклонений, связанных с микроделециями, индуцированными ионизирующими излучениями, практически составляют не учтенный пока компонент генетического риска облучения популяций человека.
Спонтанная мутация
Мутации.
Вирусам, как и всем живым организмам, свойственны наследственность и изменчивость. На раннем этапе исследования генетики вирусов животных в основном заключались в сборе и последующей генетической и физиологической характеризации вирусных мутантов. В последнее время вирусные мутанты стали использовать в качестве специфических инструментов для исследования генетических и биохимических событий, происходящих в зараженной клетке. Работы такого рода с вирусами животных в целом запаздывали по сравнению с аналогичными работами на прокариотических системах.
Некоторые вирусы дают значительную долю мутантов при пассировании в отсутствие каких-либо известных мутагенов. Эти спонтанные мутации накапливаются в геномах вирусов и приводят к изменчивости фенотипа, которая является объектом селективного давления в ходе эволюции вируса.
Скорость спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах значительно ниже (10 -8 - 10 -11 на каждый включенный нуклеотид), чем у РНК-геномных (10 -3 - 10 -4 на каждый включенный нуклеотид). Более высокая частота спонтанных мутаций связана с низкой точностью репликации РНК-геномов, которая вероятно связана с отсутствием у РНК-репликаз корректирующей активности, свойственной ферментам, реплицирующим ДНК. Наиболее часто спонтанные мутации наблюдаются у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции, не способных к самокоррекции.
Таким образом, в то время как геномы ДНК-содержащих вирусов относительно стабильны, этого нельзя сказать об РНК-содержащих вирусах, К сожалению для генетиков, ряд факторов стимулирует неравновесие в популяции геномов, и эти факторы часто способствуют накоплению мутантов в популяции. Из-за спонтанного мутагенеза трудно поддерживать гомогенность популяции вируса. Для того чтобы обойти эту трудность, вирусы периодически реклонируют, однако мутанты часто возникают и в ходе образования бляшки, и в ходе роста вируса, поэтому бывает трудно получить генетически однородные препараты вируса с высоким титром.
Индуцированные мутации у вирусов получают при действии различных химических и физических мутагенов, которые подразделяют на действующие in vivo и in vitro .
Большая часть мутантов, выделенных в ходе исследования вирусов животных, получена из популяций дикого типа, обработанных мутагенами. Мутагены обычно применяют для того, чтобы увеличить частоту мутаций в популяции, после чего мутанты подвергают скринингу с помощью подходящего селективного давления. Основной проблемой, связанной с использованием мутагенов, является подбор подходящей дозы. Как правило, желательно получить мутанты, которые отличаются от дикого типа только одной мутацией. Для этого отбор ведут при наиболее низкой дозе мутагена, дающей достаточную частоту мутаций с желаемым фенотипом.
В системах с вирусами животных было использовано множество различных мутагенов, но все они входят в небольшое число классов, определяемых по механизму мутагенеза.
Мутагены одного класса, обычно называемые мутагенами in vitro, действуют путем химической модификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирусной частице. Азотистая кислота дезаминирует основания, в первую очередь аденин, с образованием гипоксантина, который при последующей репликации спаривается с цитозином. В результате действия азотистой кислоты на аденин происходит транзиция от АТ-пары к GС-паре. Азотистая кислота дезаминирует также цитозин, приводя к транзиции CG->-ТА. Другим мутагеном in vitro является гидроксиламин; он реагирует специфически только с цитозином и вызывает транзицию СG->-ТА. Большой класс мутагенов in vitro представлен алкилирующими агентами, которые действуют на многие позиции в основаниях. Алкилирующие агенты - нитрозогуанидин, этанметансульфонат и ме-тилметансульфонат -являются мощными мутагенами.
Во второй класс входят мутагены in vivo, которые требуют для своего действия метаболически активной нуклеиновой кислоты.
Одна группа мутагенов in vivo содержит аналоги оснований, которые включаются в нуклеиновую кислоту в ходе синтеза по правилам нормального спаривания. Включившись, эти аналоги способны претерпевать таутомерные переходы, которые приводят их к спариванию с различными основаниями, вызывая таким образом транзиции и трансверсии. Часто используют аналоги: 2-аминопу-рин, 5-бромдезоксиуридин и 5-азацитидин.
В другую группу мутагенов in vivo включены интеркалирующие агенты, которые внедряются в стопку оснований, что при последующей репликации нуклеиновой кислоты приводит к вставкам или делециям.
Примерами интеркалирующих агентов являются акридиновые красители, такие как профлавин.
Ультрафиолет также иногда используют в качестве мутагена. Основным продуктом действия ультрафиолета являются димеры пиримидинов. В ДНК пиримидиновые димеры вырезаются. Для РНК механизм ультрафиолетового мутагенеза неизвестен.
Большинству мутаций присуще свойство возврата (реверсии) к дикому типу. Каждая мутация имеет характерную частоту реверсий, которую можно точно измерить.
Классификация вирусных мутаций .
Вирусные мутации классифицируют по изменениям фенотипа и генотипа. По фенотипическим проявлениям мутации вирусов разделяют на четыре группы:
· Мутации, не имеющие фенотипического проявления.
· Летальные мутации, т.е. полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков и приводящие к утрате способности к репродукции. Мутация является летальной, если вследствие ее нарушается, например, синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.
· Условно летальные мутации, т.е. мутации с потерей способности синтезировать определенный белок или с нарушением его функции только в определенных условиях. В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (temperature sensitive) – ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39-42° С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36-37° С).
· Мутации, имеющие фенотипическое проявление, например изменение размеров бляшек под агаровым покрытием или термостабильности, по изменению спектра хозяев, устойчивости к ингибиторам и химиопрепаратам.