Лабораторная диагностика практически всех инфекционных заболеваний основана на выявлении в крови больного антител, которые вырабатываются на антигены возбудителя, методами серологических реакций. Они вошли во врачебную практику с конца девятнадцатого - начала двадцатого века.

Развитие науки помогло определить антигенную структуру микробов и химические формулы их токсинов. Это позволило создать не только лечебные, но и диагностические сыворотки. Их получают путем введения ослабленных возбудителей лабораторным животным. После нескольких дней выдержки из крови кроликов или мышей готовят препараты, используемые для идентификации микробов или их токсинов, используя серологические реакции.

Внешнее проявление такой реакции зависит от условий ее постановки и от состояния антигенов в крови больного. Если частички микробов нерастворимы, то они осаждаются, лизируются, связываются или иммобилизуются в сыворотке. Если антигены растворимы, то проявляется феномен нейтрализации или преципитации.

Реакция агглютинации (РА)

Серологическая реакция агглютинация является высокоспецифичной. Она проста в исполнении и достаточно наглядна, чтобы быстро определить наличие антигенов в сыворотке крови больного. Ее используют для постановки реакции Видаля (диагностика брюшного тифа и паратифа) и Вейгля (сыпной тиф).

Она основана на специфическом взаимодействии между антителами человека (или агглютининами) и микробными клетками (агглютеногенами). После их взаимодействия образуются частицы, которые выпадают в осадок. Это и есть положительный признак. Для постановки реакции могут использоваться живые или убитые микробные агенты, грибы, простейшие, и соматические клетки.

Химически реакция разбита на два этапа:

Специфическое соединение антител (АТ) с антигенами (АГ).
Неспецифическая - осаждение конгломератов АГ-АТ, то есть образование агглютината.

Реакция непрямой агглютинации (РПГА)

Для ее постановки используют очищенные бараньи эритроциты и красные кровяные тельца человека, предварительно обработанные антителами или антигенами (это зависит от того, что именно лаборант хочет найти). В некоторых случаях человеческие эритроциты обрабатывают иммуноглобулинами. Серологические реакции эритроцитов считаются состоявшимися, если произошло их осаждение на дно пробирки. О положительной реакции можно говорить, когда клетки располагаются в виде перевернутого зонтика, занимая все дно. Отрицательная реакция засчитывается, если эритроциты осели столбиком или в виде пуговки в центре дна.

Реакция преципитации (РП)

Серологические реакции этого типа служат для выявления крайне малых частиц антигенов. Это могут быть, например, белки (или их части), соединения белков с липидами или углеводами, части бактерий, их токсины.

Сыворотки для проведения реакции получают путем искусственного заражения животных, обычно кроликов. Таким методом можно получит абсолютно любую преципитирующую сыворотку. Постановка серологических реакций преципитации похожа по механизму действия на реакции агглютинации. Антитела, содержащиеся в сыворотке, соединяются с антигенами в образуя крупные белковые молекулы, которые осаждаются на дно пробирки или на субстрат (гель). Этот способ считается высокоспецифичным и может обнаружить даже ничтожно малые количества вещества.

Используется для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний. Кроме того, задействован в судебно-медицинской экспертизе.

в геле

Серологические реакции можно проводить не только в жидкой среде, но и в агаровом геле. Это называется метод диффузной преципитации. С его помощью изучают состав сложных антигенных смесей. Этот способ основан на хемотаксисе антигенов к антителам и наоборот. В геле они движутся навстречу друг другу с разной скоростью и, встречаясь, образуют линии преципитации. Каждая линия - один комплект АГ-АТ.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Антитоксические сыворотки способны нейтрализовать действие экзотоксина, который вырабатывают микроорганизмы. На этом и основаны данные серологические реакции. Микробиология использует этот способ для титрования сывороток, токсинов и анатоксинов, а также определения их лечебной активности. Сила нейтрализации токсина определяется условными единицами - АЕ.

Кроме того, благодаря этой реакции можно определить видовую или типовую принадлежность экзотоксина. Это применяется при дифтерии, ботулизма. Исследование можно проводить как «на стекле», так и в геле.

Реакция лизиса (РЛ)

Иммунная сыворотка, которая попадает в организм больного, обладает, кроме своей основной функции пассивного иммунитета, еще и лизирующими свойствами. Она способна растворять микробные агенты, клеточные чужеродные элементы и вирусы, поступающие в организм больного. В зависимости от специфичности входящих в состав сыворотки антител выделяют бактериолизины, цитолизины, спирохетолизины, гемолизины и другие.

Эти специфические антитела называются "комплемент". Он содержится практически во всех жидкостях тела человека, имеет сложную белковую структуру и крайне чувствителен к повышению температуры, встряхиванию, действию кислот и прямых солнечных лучей. Но в высушенном состоянии способен сохранять свои лизирующие свойства до полугода.

Существуют такие виды серологических реакций этого типа:

Бактериолиз;

Гемолиз.

Бактериолиз проводят, используя сыворотку крови пациента и специфическую иммунную сыворотку с живыми микробами. Если в крови присутствует достаточное количество комплемента, то исследователь увидит лизис бактерий, и реакция будет считаться положительной.

Вторая серологическая реакция крови заключается в том, что взвесь эритроцитов больного обрабатывают сывороткой, содержащей гемолизины, которые активизируются только в присутствии определенного комплимента. Если таковой имеется, то лаборант наблюдает растворение красных клеток крови. Данная реакция широко используется в современной медицине для определения титра комплемента (то есть его наименьшего количества, провоцирующего лизис эритроцитов) в сыворотке крови и для постановки анализа на связывание комплемента. Именно этим способом проводится серологическая реакция на сифилис -

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эта реакция используется для того, чтобы обнаружить в сыворотке крови больного антитела к инфекционному агенту, а также с целью идентифицировать возбудителя по его антигенной структуре.

До этого момента мы описывали простые серологические реакции. РСК считается сложной реакцией, так как в ней взаимодействуют не два, а три элемента: антитело, антиген и комплемент. Суть ее заключается в том, что взаимодействие между антителом и антигеном происходит только в присутствии белков комплимента, которые адсорбируются на поверхности образовавшегося комплекса АГ-АТ.

Сами антигены, после присоединения комплемента, подвергаются существенным изменениям, которые и показывают качество проведенной реакции. Это может быть лизис, гемолиз, иммобилизация, бактерицидное или бактериостатическое действие.

Сама реакция происходит в две фазы:

Образование комплекса антиген-антитело, которое визуально не заметно исследователю.
Изменение антигена под действием комплемента. Эта фазу чаще всего можно отследить невооруженным глазом. Если же визуально реакции не видно, то используют дополнительную индикаторную систему, позволяющую выявить изменения.

Индикаторная система

Данная реакция основана на связывании комплемента. В исследуемую пробирку спустя час после постановки РСК добавляют очищенные эритроциты барана и гемолитическую сыворотку, не содержащую комплемента. Если в пробирке остался несвязанный комплемент, то он присоединится к комплексу АГ-АТ, образованному между бараньими клетками крови и гемолизином, и вызовет их растворение. Это будет означать, что РСК отрицательна. Если эритроциты остались целыми, то, соответственно, реакция положительная.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Существуют две принципиально разные реакции гемагглютинации. Одна из них - серологическая, она используется для определения групп крови. В этом случае эритроциты взаимодействуют с антителами.

А вторая реакция не относится к серологическим, так как красные кровяные тельца реагируют с гемагглютининами, продуцируемыми вирусами. Так как каждый возбудитель действует только на конкретные эритроциты (куриные, бараньи, обезьяньи), то можно считать эту реакцию узкоспецифичной.

Понять, положительная реакция или отрицательная, можно по расположению клеток крови на дне пробирки. Если их рисунок напоминает перевернутый зонтик, значит, искомый вирус присутствует в крови больного. А если все эритроциты сложились наподобие монетного столбика, то искомых возбудителей нет.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это высокоспецифичная реакция, позволяющая установить вид, тип вирусов или наличие специфических антител в сыворотке крови пациента.

Суть ее заключается в том, что антитела, добавленные в пробирку с исследуемым материалом, препятствую осаждению антигенов на эритроцитах, тем самым останавливая гемагглютинацию. Это и является качественным признаком наличия в крови специфических антигенов к конкретному искомому вирусу.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В основе реакции лежит способность выявлять комплексы АГ-АТ при после их обработки флюорохромными красителями. Это метод прост в обращении, не требует выделения чистой культуры и занимает мало времени. Он незаменим для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

В практике эти серологические реакции делятся на два вида: прямые и непрямые.

Прямая РИФ производится с антигеном, который заранее обработан флюоресцирующей сывороткой. А непрямая заключается в том, что сначала препарат обрабатывают обычным диагностикумом, содержащим антигены к искомым антителам, а затем повторно наносится люминесцентная сыворотка, которая специфична к белкам комплекса АГ-АТ, и микробные клетки становятся заметны при микроскопии.

Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК проводят с участием не только АГ и АТ, но и комплемента. Поскольку она не сопровождается видимыми изменениями, для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика. В присутствии комплемента в гемолитической сыворотке происходит хорошо наблюдаемый лизис эритроцитов. Принцип метода состоит в том, что если в опыте комплекс АГ-АТ образовался и комплемент связался с ним (т.е. в растворе свободного комплемента не осталось), то лизис эритроцитов не произойдет, и эритроциты осядут на дно пробирки. Если комплекс не формируется, комплемент остается свободным и реагирует с гемолитической системой, вызывая в результате лизис эритроцитов. Этот механизм лежит в основе реакции Вассермана (диагностика сифилиса). Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по РСК. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей АТ к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиз эритроцитов не происходит в связи с отсутствием важного звена процесса связывания АТ с АГ - комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, то образуется иммунный комплекс и произойдут склеивание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов.

В норме уровень комплемента сыворотки крови составляет 20-40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических - ее уменьшение. Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или приобретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отметить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные аномалии белков человека. Они могут играть патогенетическую роль при таких заболеваниях и синдромах, как:

рецидивирующие бактериальные пиогенные инфекции органов дыхания, кожи и других органов: пневмонии, бронхоэктазы, рецидивирующий синусит, пиодермия, генерализованные бактериальные инфекции, септицемия;
рецидивирующие менингококковые и гонококковые инфекции (менингококковый менингит, диссеминированные гонококковые инфекции, гонококковые артриты и др.);
аутоиммунные, аллергические заболевания и болезни иммунных комплексов: системная красная волчанка, дерматомиозит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, болезнь Шенлейн - Ге- ноха, синдром Шегрена, тромбоцитопеническая пурпура, склеродермия, ювенильный ревматоидный артрит, рецидивирующий ангионевротический отек (особенно часто - ларингоспазм), дерматозы, фоточувствительность и др.

Реакция связывания комплемента используется для лабораторной диагностики риккетсиозов, вирусных инфекций (гриппа, кори, клещевого энцефалита и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ-АТ. Комплемент адсорбируется на Ес-фрагменте иммуноглобулинов О и М. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие АГ и АТ. В качестве материала, содержащего АТ, используется исследуемая сыворотка, к которой добавляется известный АГ. К этой системе добавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37 °С в течение 1 ч. Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолизины к эритроцитам барана). К смеси АГ-АТ-комплемент (1-я фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37 °С в течение 30-60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Разрушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ-АТ, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в исследуемой сыворотке содержатся специфические АТ к диагностическому АГ. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических АТ комплекс АГ-АТ не образуется, а комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Все компоненты РСК за исключением исследуемой сыворотки должны быть оттитрованы (рис. 10.9).

Рис. 10.9. а - лизис сенсибилизированных эритроцитов в присутствии комплемента: б- отсутствие гемолиза вследствие фиксации комплемента комплексом АГ-АТ; в - лизис эритроцитов в результате отсутствия комплекса АГ-АТ

Реакция разработана Ж. Борде и О. Жангу в 1901. Которые установили, что при образовании комплекса антиген – антитело происходит связывание им комплемента.

Образовавшееся соединение мелкодисперсно и не определяется визуально. Для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы применили индикаторную гемолитическую систему: эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется, комплемент остаётся свободным. Комплемент адсорбируется только на комплексе антиген - антитело, отдельно на антигене или антителе он не адсорбируется. Поэтому при добавлении к испытуемой системе гемолитической системы, состоящей из уже готового комплекса антиген - антитело (эритроциты барана и антитела к ним), комплемент присоединяется к этому комплексу, вызывая гемолиз эритроцитов барана - видимый результат.

Реакция связывания комплемента (РСК) отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РСК применяется в серодиагностике гонореи, сифилиса, коклюша, всех риккетсиозов, многих вирусных заболеваний. Как и другие серологические реакции, РСК можно применить и для серотипирования.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют две системы антиген - антитело и комплемент.

Для постановки РСК необходимы:

Сложность реакции обуславливается количеством участвующих ингредиентов и, главным образом, необходимостью определять точные количественные соотношения их. Поэтому постановке основного опыта предшествует титрование её ингредиентов.

Гемолитическая сыворотка готовится в производственных условиях путем 3-4 кратной внутривенной иммунизации кролика 50 % взвесью бараньих эритроцитов и инактивируется при 56 °С в течение 30 мин. Для её титрования берутся последовательно уменьшающиеся дозы (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% взвесь эритроцитов, комплемент 1:10 в равных объёмах (но 0,5 мл). На этикетке ампул с гемолитической сывороткой обозначен её титр - максимальное разведение, которое обеспечивает полный лизис 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента в течение часа при 37°С. Для РСК используют разведение сыворотки, увеличенное против титра в 3 раза.

Взвесь эритроцитов барана 3% получают из дефибринированной крови барана путем отмывания изотоническим раствором NaCl.

Комплемент - свежая сыворотка крови морской свинки или высушенная - титруется перед опытом: последовательно уменьшающиеся дозы (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + гемолитическая система (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате при 37°С определяют титр комплемента - наибольшее разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25%, т.к. активность комплемента в опыте может оказаться несколько подавленной другими комплементами реакции (антиген, сыворотка).

Антиген - взвесь убитых микроорганизмов, их лизаты, полные антигены, гаптены, экстракты тканевых липидов -иногда связывает комплемент даже в отсутствии иммунной сыворотки, поэтому его также необходимо оттитровать. Берутся последовательно уменьшающиеся дозы антигена + рабочая доза комплемента + гемолитическая система. Титром антигена является его наименьшая доза, при которой наступает отчётливый гемолиз. Для РСК берут дозу антигена, вдвое уменьшенную против титра во избежание связывания комплемента.

Исследуемая сыворотка перед опытом подвергается инактивированию при 56°С в течение 30 мин. Для инактивирования её собственного комплемента.

Все компоненты реакции связывания комплемента берутся в равных объёмах.

Постановка основного опыта.

После установления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК. В реакции участвует также титрованные сыворотки: заведомо здорового и заведомо больного (отрицательно и положительная сыворотки соответственно). Как и испытуемую сыворотку, контрольные - тоже инактивируют при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в две фазы:

I фаза - специфическая - инкубация смеси антигена, антитела и комплемента в термостате при 37°С в течение 30 мин.

II фаза - индикаторная - определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы (предварительно помешенной на 30 мин. в термостат) и инкубации в термостате при 37°С в течение 20 -30 мин.

Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл.). Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной, когда жидкость интенсивно окрашивается ("лаковая кровь"). Степень интенсивности гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величине осадка эритроцитов на дне (+ + + +, + + +, + +, +).

Учёт результатов РСК.

Учитывать результаты опыта (испытуемой сывороткой) можно лишь в том случае, если все контроля прошли правильно.

В пробирке №2 с положительной сывороткой (содержащей антитела к данному антигену) гемолиза не должно быть, т.к. комплемент связан в первой специфической системе, а гемолитическая система осталась без комплемента - эритроциты оседают на дно, надосадочная жидкость прозрачна.

В пробирке №3 с отрицательной сывороткой, сывороткой здорового человека, не содержащей антитела к данному антигену, гемолиз должен быть, поскольку в первой фазе реакции не произошло образование комплекса антиген -антитело (из - за отсутствия антител к данному антигену) и комплемент остался свободным. При добавлении гемосистемы во II фазе реакции комплемент адсорбировался на готовом иммунном комплексе эритроциты барана плюс антитела к ним; произошел лизис эритроцитов барана (гемолиз).

Наличие гемолиза в контроле сыворотки и антигена (пробирки №4 и 5) указывает, что их дозы были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемента не связывают. Оставшийся свободным в специфической системе комплемент адсорбируется иммунным комплексом гемолитической системы, происходит гемолиз.

Гемолиз в контроле комплемента (пробирка №6) свидетельствует об активности комплемента и правильности выбора его рабочей дозы.

В контроле гемолитической системы (пробирка №7) при правильной работе этой системы не должно быть даже следов гемолиза, т.к. в ней отсутствует комплемент.

При безупречных контрольных результатах можно учитывать опыт (пробирка №1). Отсутствие гемолиза расценивают как положительный результат. Он свидетельствует о том, что в испытуемой сыворотке обнаружены антитела к данному антигену (человек болен). При соответствии антигена антителу образуется комплекс антиген - антитело, который связывает комплемент (I фаза). При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов во II фазе не будет. Наличие гемолиза является отрицательным результатом, свидетельствующим об отсутствии антител к данному антигену (человек здоров). Комплемент остается свободным и при добавлении гемолитической системы присоединяется к комплексу эритроцит - гемолизины, вызывая гемолиз.

Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных.

РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая — взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая — выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают — сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген — антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген — антитело.

Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген — антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.

Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24—48 ч) или сухой комплемент в ампулах.

Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и титруют для установления титра — наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20—30% надбавку.

Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к антигену — отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде—Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.

Реакция связывания комплемента (РСК) – это метод серологического анализа, который по своей чувствительности сравним с методами преципитации, агглютинации и нейтрализации. РСК представляет собой метод, где используются две системы антиген-антитело:

первая – специфическая;

вторая – индикаторная (гемолитическая).

Для проведения РСК необходимы 5 компонентов: диагностируемый антиген, диагностические антитела, антиген-индикатор (эритроциты барана), индикаторные антитела (кроличьи гемолизины), комплемент.

Специфическое взаимодействие антигена и антитела сопровождается связыванием комплемента. Образовавшийся комплекс визуально не проявляется. В качестве индикатора используется гемолитическая система. Гемолитическая сыворотка сенсибилизирует эритроциты к действию комплемента, в присутствии которого происходит лизис эритроцитов (гемолез). Если гемолиза нет, значит комплемент связан первой системой, и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу – положительный ответ. Если антитело не соответствует антигену, комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой, вызывая гемолиз – реакция отрицательная.

Для постановки РСК все ингредиенты реакции подготавливают и титруют до проведения основного опыта.

Сыворотку (больного или диагностическую) накануне проведения реакции прогревают на водяной бане при температуре 56ºС в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Некоторые сыворотки, особенно иммунизированных животных, обладают антикомплементарными свойствами, т.е. способностью связывать комплемент в отсутствии гомологичного антигена. Антикомплементарность устраняют путем обработки их углекислым газом, прогреванием при температуре 57-58ºС, однократным замораживанием при температуре -20ºС или -70ºС и удалением осодка центрифугированием, добавлением к сыворотке комплемента в объеме 1:10 сыворотки и прогреванием ее после инкубации на холоде в течение 18-20 ч. Для предотвращения антикомплементарности сывороток их хранят в лиофилизированном виде или замороженном состоянии при низких температурах.

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганиз мов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вируссодержащие материалы. Многие антигены из микроорганизмов получают производственным путем. Антикомплементарность антигенов устраняют при помощи таких методов, как термолиз (многократное замораживание и оттаивание), обработка жирорастворителями (эфиром, хлороформом, ацетоном), спиртами (метанолом, этанолом) и т.д.

В качестве комплемента используют сыворотку морской свинки, взятую непосредственно перед опытом; можно также применять сухой комплемент. Чтобы получить основной роаствор для последующего титрования, комплемент разводят 1:10 изотоноческим раствором натрия хлорида.

Эритроциты барана используют в виде 3 взвеси на изотоническом растворе натрия хлорида. Кровь (100-150 мл) берут из яремной вены, помещают в стерильную банку со стеклянными бусами, дефибринируют путем встряхивания в течение 10-15 мин и фильтруют через 3-4 слоя стерильной марли для удаления фибрина. Эритроциты отмывают 3 раза изотоническим раствором натрия хлорида, доливая его к осадку эритроцитов до первоначального объема крови. Эритроциты можно хранить 5-6 дней при температуре 4-6ºС. Срок хранения эритроцитов увеличивается при их консервировании с формалином.

Гемолитическую сыворотку для РСК получают следующим образом Иммунизируют кроликов путем введения им в вену уха 50% взвеси отмытых эритроцитов барана (по 1 мл 4-6 раз через день). Через 7 дней после последней инъекции получают пробную сыворотку. Если титр сыворотки не ниже 1:1200, то делают кровопускание. Сыворотку прогревают 30 мин при температуре 56ºС. Для предупреждения бактериального пророста в гемолитическую сыворотку добавляют консервант (мертиолят 1:10000 или 1 борную кислоту).

Гемолитическая система состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки (взятой в тройном титре) и 3 взвеси эритроцитов барана. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 30 мин.

Титрование гемолитической сыворотки. Сыворотку титруют путем соединения 0,5 мл ее (в разведениях 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 и т.д.) с 0,5 мл 3 взвеси эритроцитов и 0,5 мл свежего комплемента в разведении 1:10. Объем смеси для реакции в контрольных пробирках доводят до 1,5 мл, добавляя изотонический раствор натрия хлорида. Результаты реакции учитывают через 1 ч инкубации при температуре 37ºС. Титром гемолитической сыворотки считают ее наибольшее разведение, вызывающее полный гемолиз. Хранят сыворотку в лиофилизированном виде.

Схема титрования гемолитической сыворотки

Ингредиент	Номер пробирки
Ингредиент		Контроль комплемента	контроль гемолитической сыворотки	Контроль эритроцитов
Гемолитическая сыворотка в разведениях 1:600, 1:1200, 1:1600 и т.д.
Взвесь эритроцитов барана
Комплемент в разведении 1:10

Титрование комплемента. Перед проведением опыта основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и добавляют в каждую изотонический раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1,5 мл. Пробирки помещают в термостат при температуре 37ºС на 45 мин, затем добавляют в них гемолитическую систему и выдерживают в термостате в течение 30 мин, после чего определяют титр комплемента.

Для опыта берут рабочую дозу комплемента (содержащуюся в объеме 0,5 мл), которая выше титра на 20-30%.

Схема титрования комплемента

Ингредиент, мл

Номер пробирки

Контроль

Комплемент в разведении 1:10

Изотонический раствор натрия хлорида

Термостат при температуре 37ºС в течение 45 мин

Термостат при температуре 37ºС в течение 30 мин

Титрование антигена. Антигены, используемые для РСК могут адсорбировать какое-то количество комплемента, т.е. обладать антикомплементарными свойствами. Поэтому перед проведением опыта антигены титруют в присутствии рабочей дозы комплемента. В меньшей степени антикомплементарные свойства выражены у специфических антигенов, выпускаемых производственным путем. Их титр определяют не перед каждым опытом, а один раз в месяц, учитывая возможность его уменьшения в процессе хранения.

Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающемся количестве от 0,5 до 0,05 мл, доводя объем в них до 1 мл путем добавления раствора натрия хлорида. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37ºС. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, снова выдерживают их в течение 1 ч в термостате и учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают наименьшее его количество, при котором наступает полный гемолиз. Для РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-1/3 титра. Антигены, в присутствии которых титр комплемента уменьшается более чем на 30%, непригодны для реакции.

Схема титрования антигена

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Проведение основного опыта РСК. Общий объем ингредиентов реакции – 2,5 мл, объем рабочей дозы каждого из них – 0,5 мл. В первую пробирку вносят сыворотку в соответствующем разведении, антиген и комплемент, во вторую – сыворотку в соответствующем разведении, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки), в третью – антиген, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль антигена). Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая по 2 мл гемолитической сыворотки в тройном титре (по отношению к указанному в инструкции) и 3% взвеси эритроцитов барана (по отношению к исходному объему крови). Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 1 ч, затем в первые 3 пробирки (первая система) добавляют по 1 мл гемолитической системы (вторая система). После тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь помещают в термостат на 1 ч при температуре 37ºС.

Схема проведения основного опыта РСК

Номер системы	Ингредиент, мл	Номер пробирки
Номер системы	Ингредиент, мл		Контроль сыворотки	Контроль антигена
	Исследуемая сыворотка в разведениях 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 и т.д.
	Антиген (рабочая доза)
	Комплемент (рабочая доза)
	Изотонический раствор натрия хлорида

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Результаты реакции учитывают предварительно – после извлечения пробирок из термостата и окончательно – после пребывания их в течение 15-18 ч в холодильнике или при комнатной температуре.

При окончательном учете интенсивность реакции выражают плюсами: (++++) – резко положительная реакция, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно); (+++, ++) – положительная реакция, проявляющаяся усилением окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшением количества эритроцитов в осадке; (+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов). При отрицательной реакции (–) наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно розовую окраску (лаковая кровь).

Предложен ряд модификаций РСК, отличающихся повышенной чувствительностью и меньшим объемом используемых ингредиентов. Так, например, при вирусологических исследованиях объем ингредиентов для РСК на холоде – 1 мл. Для капельной РСК берут 1 каплю сыворотки + 1 каплю антигена + 1 каплю комплемента + 2 капли гемолитической системы.

Реакция связывания комплимента нашла самое широкое распространение в микробиологической и серологической диагностике.

С помощью РСК обнаруживают комплементсвязывающие антитела в сыворотке крови больных сифилисом, сапом, хронической гонореей, риккетсиозами, вирусными заболеваниями и др.

Особый интерес РСК представляет для клинической иммунологии. Реакцию применяют для выделения различных субпопуляций лимфоцитов, для выявления антигенов HLA на тромбоцитах, перевиваемых лимфобластах, фибробластах, опухолевых клетках и тромбоцитоспецифических антигенов, а также соответствующих антител.